李樹靜，馮春濤，胡智輝，朱化彬，余文莉* ，趙善江*

(1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050299; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193)

母牛發(fā)情周期中卵巢卵泡發(fā)育數(shù)量及質(zhì)量直接決定著其繁殖性能[1-2]，正常生理狀態(tài)下，卵泡發(fā)育、成熟和排卵不僅受下丘腦-垂體-卵巢生殖軸的激素調(diào)節(jié)[3-5]，而且還受抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)等卵巢自身分泌激素的調(diào)節(jié)[6]。AMH是由卵巢早期有腔卵泡的顆粒細(xì)胞合成分泌的一種糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的一員，AMH合成后釋放進(jìn)入卵泡液和外周血，可以通過放射免疫或者酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等方法從血樣中檢測出來[6]。多項研究發(fā)現(xiàn)，AMH與卵巢儲備和發(fā)育潛能關(guān)系密切，外周血中AMH濃度可以較為準(zhǔn)確地反映卵巢上發(fā)育的有腔卵泡數(shù)量(antral follicle count, AFC)和質(zhì)量[6-9]，并對動物超數(shù)排卵(超排)的效果有直接影響[6, 10-11]。

AMH水平下降與多個物種雌性動物的生殖力下降相關(guān)，因而，血液中AMH濃度高低可作為母牛繁殖性能高低的內(nèi)分泌標(biāo)記物[12-13]。目前，在人的輔助生殖中，AMH已經(jīng)比較廣泛地用于預(yù)測女性卵巢儲備和激素處理下卵巢產(chǎn)生可用卵子的可能性。同樣，牛AMH水平也可以用于選擇繁殖力或者人工授精受胎率高的奶?；蛉馀?，作為超數(shù)排卵-胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)篩選供體牛的一個高效標(biāo)志分子，可以幫助選擇能夠提供更多可移植胚胎的供體母牛，以增加體內(nèi)胚胎生產(chǎn)的效率。

當(dāng)前，MOET技術(shù)已經(jīng)在全球商業(yè)化應(yīng)用，成為牛新品種培育和快速擴(kuò)繁的重要技術(shù)手段[14-15]。然而在過去的30年里，通過超數(shù)排卵供體牛生產(chǎn)的可用胚胎數(shù)量一直沒有得到顯著的提高[16-17]，而這其中不同供體牛卵巢對外源促性腺激素處理的反應(yīng)不穩(wěn)定可能是導(dǎo)致體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率低的重要原因之一[18]。因此，近年來，從事胚胎生產(chǎn)的研究人員一直在致力于尋找可預(yù)測供體母牛超排反應(yīng)效果、胚胎生產(chǎn)數(shù)量的分子標(biāo)記物，以用于預(yù)測和篩選超排反應(yīng)良好的供體牛，從而獲得更多的可用胚胎[19-21]。研究表明，供體牛血清中AMH濃度與超排后獲得胚胎數(shù)量相關(guān)性高[22-24]。但是國內(nèi)關(guān)于供體牛外周血AMH濃度與體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的研究較少，尤其是對超排處理過程不同時間點供體牛外周血AMH濃度與供體牛MOET獲得胚胎數(shù)量相關(guān)性的研究少，僅見薛建華等[25]研究的供體牛血液中AMH濃度對荷斯坦供體?？色@得胚胎數(shù)的影響，畢江華等[26]等研究的重復(fù)超排過程中血液AMH濃度對超排效果的影響，但是上述研究的研究內(nèi)容較為單一，且AMH采樣時間點單一，部分研究的試驗動物頭數(shù)也較少。

本試驗分別采集CIDR埋置、人工授精和胚胎回收3個時間點的外周血，研究體內(nèi)胚胎實際生產(chǎn)過程中不同時間點供體牛外周血AMH濃度與體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的相關(guān)性，以期為供體牛的高效篩選提供一定的應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

供體母牛為營養(yǎng)狀況良好、發(fā)情周期正常、14～16月齡的96頭荷斯坦青年牛，試驗地點為石家莊天泉良種奶牛有限公司，時間為2019年7～9月。

1.2 試驗試劑

促卵泡激素(FSH，F(xiàn)olltropin-V， 稀釋后20 mL·瓶-1， 含NIH-FSH-P1 20 mg· mL-1，Bioniche公司生產(chǎn))、孕酮陰道栓 (CIDR，1.56 g孕酮·支-1，Vetoquinol公司生產(chǎn))、氯前列腺稀醇(PG，0.322 mg·mL-1，齊魯動物保健品公司生產(chǎn))，保存液、沖胚液均由Bioniche公司生產(chǎn)；AMH檢測試劑盒(Beckman)。

1.3 試驗設(shè)計

根據(jù)供體牛的選擇標(biāo)準(zhǔn)，挑選符合條件的健康供體母牛。分別采集供體牛胚胎生產(chǎn)過程中CIDR埋置、人工輸精以及胚胎回收當(dāng)天的外周血，檢測AMH濃度的同時測量記錄供體牛體重，分別將不同時期的AMH濃度和體重按照高(分布最高的25%)、中等(分布中間的25%～75%)、低(分布最低的25%)分為3組。

1.3.1 超數(shù)排卵 供體母牛超排處理時間和操作見圖1。試驗采用連續(xù)4 d 遞減注射FSH方法超排處理供體牛，1瓶FSH(400 mg)用20 mL無菌超純水稀釋為20 mg· mL-1。具體操作：供體牛埋置CIDR的同時肌肉注射10 mL 維生素ADE(埋植當(dāng)天計為第0天)，埋置CIDR后第5 天開始超數(shù)排卵處理，每天07:00、19:00 分2次肌肉注射FSH(第5天：3 mL·頭-1×2次；第6 天：2 mL·頭-1×2次；第7天：1 mL·頭-1×2次；第8 天：0.5 mL·頭-1×2次)； 第7天兩次肌肉注射FSH同時注射兩次PG(0.6 mg·頭-1)并撤出CIDR；第9天全天人工觀察發(fā)情，站立接受爬跨后10～12 h進(jìn)行人工授精(未發(fā)情牛同樣參加配種)，間隔10～12 h后進(jìn)行第二次人工授精，每天早、晚兩次觀察供體母牛自然發(fā)情情況并記錄。第16天采用非手術(shù)方法采集胚胎。

圖1 體內(nèi)胚胎生產(chǎn)流程示意圖

1.3.2 胚胎采集與質(zhì)量鑒定 對供體牛進(jìn)行利多卡因硬膜外麻醉后，高錳酸鉀水消毒外陰，紙巾擦拭后酒精消毒并用生理鹽水沖洗干凈。用15號采卵管(w?rrlein 15)采集胚胎，兩側(cè)子宮角共用400 mL PBS液回收胚胎。體式顯微鏡下收集胚胎并根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定胚胎質(zhì)量，分為可用胚胎(A、B級)和不可用胚胎(退化胚、未受精胚)。

1.3.3 血液采集及處理 埋植CIDR(第0 天)當(dāng)天上午、第一次人工授精時和胚胎回收當(dāng)天各采集供體血液5 mL(促凝管，河北鑫樂科技有限公司)。血樣室溫下靜置2 h后2 500 r·min-1離心10 min，收取血清并按試驗編號分裝標(biāo)記，于-20 ℃冰箱保存。ELISA檢測血清中AMH濃度。

1.3.4 測定指標(biāo)和數(shù)據(jù)篩選 測定不同試驗組間AMH濃度、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)、A級優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、不可用胚胎數(shù)、退化胚胎數(shù)、未受精卵母細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)。所有數(shù)據(jù)按照“平均數(shù)±3倍標(biāo)準(zhǔn)差”的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行剔除。經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選，符合上述條件的供體牛為92頭。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.2軟件分別對不同供體類型、超排次數(shù)、FSH劑量和同期發(fā)情處理方法進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。P<0.05 表明組間差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 外周血AMH濃度分析

結(jié)果表明，體內(nèi)胚胎生產(chǎn)過程中的3個時間點(CIDR埋置、人工輸精和胚胎回收)外周血AMH濃度均為正態(tài)分布，從CIDR埋置到胚胎回收，其濃度呈明顯減少的趨勢(圖2)。CIDR埋置時平均AMH濃度為(113.51±2.66) ng·L-1，最大值為224.10 ng·L-1，最小值72.12 ng·L-1，上四分位數(shù)為126.07 ng·L-1，下四分位數(shù)為96.66 ng·L-1。人工輸精時平均AMH濃度為(86.27±3.74)ng·L-1，最大值為225.54 ng·L-1，最小值32.98 ng·L-1，上四分位數(shù)為112.06 ng·L-1，下四分位數(shù)為55.18 ng·L-1。胚胎回收時平均AMH濃度為(50.40±1.67)ng·L-1，最大值為116.64 ng·L-1，最小值34.48 ng·L-1，上四分位數(shù)為54.44 ng·L-1，下四分位數(shù)為40.74 ng·L-1。因此，為明確各個時間點AMH濃度的篩選閾值，本研究將不同時期的外周血AMH濃度按照高(濃度分布最高的25%)、中等(濃度分布中間的25%～75%)、低(濃度分布最低的25%)分為3組，并檢驗了這3組之間頭均回收胚胎數(shù)、頭均可用胚胎數(shù)、頭均退化胚胎數(shù)和頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)間的差異。

圖2 體內(nèi)胚胎生產(chǎn)不同時間點供體牛外周血AMH濃度的分布圖

2.2 CIDR埋置時外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率的影響

CIDR埋置時外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率的影響分析結(jié)果見表1。從表1可以看出，外周血AMH濃度對頭均回收胚胎數(shù)和頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)均有顯著影響(P<0.05)，高濃度組頭均回收胚胎數(shù)(9.38枚)顯著高于中等濃度組(6.47枚)(P<0.05)，高濃度組頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)(2.15枚)顯著高于其余兩組(P<0.05)，說明CIDR埋置時外周血中高AMH濃度可能會刺激更多卵泡募集和發(fā)育，后期FSH處理后形成更多的優(yōu)勢卵泡排卵。但是，頭均回收胚胎數(shù)增加的同時頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)也顯著增加，這可能是因為人工輸精時間與排卵時間不吻合導(dǎo)致，高濃度組更多的優(yōu)勢卵泡排卵，但是排卵時間不一致，排卵周期更長，因此觀察到發(fā)情后12 h配種可能并不能覆蓋所有排卵的卵母細(xì)胞，導(dǎo)致部分后排或者先排的卵母細(xì)胞未能受精，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步細(xì)化研究其影響機(jī)制。

表1 CIDR埋置時母牛血清中AMH濃度與胚胎生產(chǎn)效率的關(guān)系

2.3 人工輸精時外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率的影響

人工輸精時外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率的影響分析結(jié)果見表2。從表2可以看出，人工輸精時外周血AMH濃度對頭均回收胚胎數(shù)、頭均可用胚胎數(shù)、頭均退化胚胎數(shù)和頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。人工輸精時大多數(shù)優(yōu)勢卵泡已經(jīng)排卵，AMH濃度明顯低于CIDR 埋置時，這與Maggi等[3]的研究結(jié)果一致，隨著卵泡的發(fā)育，AMH濃度逐漸降低。但是，總體來看，高濃度組的體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率最低，無論是頭均回收胚胎數(shù)，還是頭均可用胚胎數(shù)均低于其余兩組，且頭均退化胚胎數(shù)和頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)均最高，高濃度AMH代表高組還有部分卵泡沒有排卵，從而導(dǎo)致高濃度組頭均可用胚胎和胚胎總數(shù)均降低。

表2 人工輸精時母牛血清中AMH濃度與胚胎生產(chǎn)效率的關(guān)系

2.4 胚胎回收時外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率的影響

胚胎回收時外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率的影響分析結(jié)果見表3。從表3可以看出，胚胎回收時外周血AMH濃度對頭均回收胚胎數(shù)、頭均可用胚胎數(shù)、頭均退化胚胎數(shù)和頭均未受精卵母細(xì)胞數(shù)均無顯著影響(P>0.05)，這可能是因為當(dāng)體內(nèi)胚胎生產(chǎn)執(zhí)行到胚胎回收時，卵巢上黃體正處于發(fā)育期，機(jī)體內(nèi)孕酮含量高，卵泡發(fā)育被抑制，此時AMH濃度高的牛只可能說明下一個發(fā)情周期時其卵泡募集和發(fā)育數(shù)量多，并不能作為體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的標(biāo)記之一。

表3 回收胚胎時母牛血清中AMH濃度與胚胎生產(chǎn)效率的關(guān)系

2.5 體重對胚胎生產(chǎn)效率的影響

在研究體內(nèi)胚胎生產(chǎn)中3個時間點(CIDR埋置、人工輸精和胚胎回收)外周血AMH濃度對體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的影響以外，本研究還收集了本次試驗92頭供體牛體重數(shù)據(jù)，按照“平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差”篩選后，按照高(分布最高的25%，>384 kg)、中等(濃度分布中間的25%～75%，350～384 kg)、低(濃度分布最低的25%，<350 kg)分為3組，用于分析體重與體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率之間的關(guān)系。從表4中可以看出，雖然各組間沒有顯著差異(P>0.05)，但是高體重組頭均可用胚胎數(shù)、頭均回收胚胎數(shù)均低于中等體重組和低體重組，其中，中等體重組最優(yōu)，說明體重適中更適合體內(nèi)胚胎生產(chǎn)，過胖或過瘦都有可能會影響體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率。

表4 供體牛體重與胚胎生產(chǎn)效率的關(guān)系

3 討 論

超數(shù)排卵生產(chǎn)體內(nèi)胚胎是牛胚胎移植商業(yè)應(yīng)用獲得胚胎來源的重要途徑之一[27-29]。雖然研究人員一直在不斷改進(jìn)牛胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)，但是超數(shù)排卵后供體平均獲得可用胚胎數(shù)在過去幾十年里也沒有顯著提高，平均可用胚胎數(shù)仍為6～7枚，這可能與供體母牛對超數(shù)排卵反應(yīng)差異較大，即超數(shù)排卵時卵巢狀態(tài)有關(guān)[30-31]。研究發(fā)現(xiàn)，牛外周血液中AMH含量與母牛卵巢活性、有腔卵泡數(shù)量和卵泡質(zhì)量有關(guān)[24]。

AMH發(fā)揮生物學(xué)功能需要與顆粒細(xì)胞上的AMH受體Ⅰ型(AMHR1)和Ⅱ型(AMHR2)二聚體結(jié)合，隨后啟動AMH的信號傳導(dǎo)過程。Poole等[32]研究發(fā)現(xiàn)，小卵泡(5～8 mm)中AMH受體比大卵泡(13～24 mm)的數(shù)量更多，說明年輕卵泡比老年卵泡產(chǎn)生更多的AMH。Monniaux等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著奶牛卵泡直徑的增加，AMH的濃度顯著下降，說明AMH主要在卵泡發(fā)育前期發(fā)揮作用，例如卵泡募集等。因而，外周血液AMH含量可能與超數(shù)排卵后供體母牛獲得胚胎數(shù)量有關(guān)，高濃度AMH組牛只超排后可見更多的優(yōu)勢卵泡或可以通過活體采卵回收到更多的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，Monniaux等[10]研究發(fā)現(xiàn)，血液AMH濃度在100～200 pg·mL-1之間和大于200 pg·mL-1的供體母牛頭均獲得胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)均顯著高于AMH濃度低于100 pg·mL-1的供體牛。畢江華等[33]等重復(fù)超數(shù)排卵荷斯坦供體母牛發(fā)現(xiàn)，血液中AMH含量在1 000～1 100 pg·mL-1的供體牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率顯著高于含量在500～800 pg·mL-1的供體母牛，因此，外周血AMH濃度可作為預(yù)測供體胚胎產(chǎn)量的一項內(nèi)分泌指標(biāo)[34]。但是上述研究測定的都是采集胚胎后供體血清中AMH濃度，且每組試驗牛數(shù)量較少。

因此，本試驗增加多個采樣點，旨在研究供體牛超排過程中不同時間外周血AMH濃度與荷斯坦奶牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的相關(guān)性，優(yōu)化供體牛篩選標(biāo)準(zhǔn)，以提高體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，CIDR埋置時，外周血AMH濃度對胚胎生產(chǎn)效率有顯著影響，高AMH濃度組頭均回收胚胎數(shù)(9.38枚)顯著高于其余兩組(6.47和7.50枚)，說明CIDR埋置時外周血中高AMH濃度可能會刺激更多卵泡募集和發(fā)育，后期FSH處理后形成更多的優(yōu)勢卵泡排卵。但是，頭均回收胚胎數(shù)增加的同時頭均未受精數(shù)也顯著增加，這可能是因為人工輸精時間與排卵時間不吻合導(dǎo)致，雖然高AMH濃度組有更多的優(yōu)勢卵泡排卵，但是排卵時間不一致，排卵周期可能更長，因此，觀察到發(fā)情后12 h配種可能并不能覆蓋所有排卵的卵母細(xì)胞，導(dǎo)致部分后排或者先排的卵母細(xì)胞未能受精。上述結(jié)果說明，不僅開始超數(shù)排卵時供體牛卵巢對FSH的反應(yīng)可影響超數(shù)排卵效果，而且超數(shù)排卵處理前供體牛外周血AMH濃度也直接影響超數(shù)排卵獲得的胚胎總數(shù)和可用胚胎數(shù)[35-36]。后續(xù)應(yīng)針對高AMH濃度組未受精卵的增加開展進(jìn)一步研究，以進(jìn)一步提高高AMH濃度組的可用胚胎數(shù)。此外，依托供體牛體重數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，盡管不同體重組之間體內(nèi)胚胎的生產(chǎn)效率無顯著性差異，但是，體況適中組牛只的可用胚胎數(shù)、回收胚胎數(shù)等均優(yōu)于其他兩組，尤其是優(yōu)于體重偏胖組，這與Souza 等[11]的研究結(jié)果一致，說明體重適中更適合體內(nèi)胚胎生產(chǎn)，過胖或過瘦都有可能會影響體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，在華北地區(qū)現(xiàn)有的生產(chǎn)管理水平下，荷斯坦青年牛超排前外周血AMH濃度可以一定程度反映供體牛超排的效果，高AMH濃度牛只的胚胎總數(shù)更多，可以作為供體牛篩選條件之一，且供體牛選擇時宜選用體況適中的牛只。本研究結(jié)果對荷斯坦青年奶牛體內(nèi)胚胎高效生產(chǎn)和核心群的建立具有一定的參考價值。