邱清華，歐陽(yáng)克蕙，蘇華維，曹兵海

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 營(yíng)養(yǎng)飼料開(kāi)發(fā)工程研究中心 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，南昌 330045； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

異性孿生雌性不育是異卵雙胎或多胎后代中雌性個(gè)體不具備生育能力的現(xiàn)象[1]，在奶牛和肉牛的雙胎中比較常見(jiàn)，其后代對(duì)應(yīng)的雌性個(gè)體稱為異性孿生不育母牛。在過(guò)去的幾十年里，牛的雙胎率不斷提高并有逐步增加的趨勢(shì)，目前在肉牛中為1%左右，荷斯坦奶牛約為5%，部分牧場(chǎng)可高達(dá)10%[2-5]；據(jù)Del Río等[6]報(bào)道，荷斯坦異性孿生占雙胎比例高達(dá)44%，由此推算產(chǎn)生的異性孿生母牛數(shù)量也將增加。然而，異性孿生母牛中約有90%不具備繁殖能力，僅有10%左右能正常繁育下一代[7-9]。不育的母牛不但無(wú)法繁育下一代和產(chǎn)乳，也不能用于母牛群體遺傳性能的改良，對(duì)于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值不大；然而，若將這部分母牛當(dāng)作肉牛進(jìn)行飼養(yǎng)育肥，對(duì)于肉牛育肥場(chǎng)而言，能以低價(jià)獲取育肥牛源；對(duì)于奶牛場(chǎng)而言，可以降低單一出售牛奶受市場(chǎng)奶價(jià)波動(dòng)的影響。此外，若能在早期快速、準(zhǔn)確地將可育的異性孿生母犢鑒別出來(lái)，則可以在出生時(shí)甚至胎兒期就做出是否留養(yǎng)用作為后備母牛的決定，這可以在一定程度上減少全部淘汰帶來(lái)的母牛資源浪費(fèi)和盲目留養(yǎng)帶來(lái)后期飼養(yǎng)成本增加的問(wèn)題?；谝陨鲜聦?shí)背景，本文重點(diǎn)從異性孿生母牛的可育性鑒別和不育母牛的利用兩大方面對(duì)國(guó)內(nèi)外近些年的研究做總結(jié)和討論，以期為國(guó)內(nèi)奶牛和肉牛牧場(chǎng)的異性孿生母牛利用和科研開(kāi)發(fā)提供思路。

1 異性孿生母牛不育的形成機(jī)理

目前，異性孿生母牛不育的形成機(jī)理主要有激素學(xué)說(shuō)和嵌合學(xué)說(shuō)兩種解釋。激素學(xué)說(shuō)認(rèn)為，異卵雙胎在妊娠2周至30 d雌雄胎兒間絨毛膜發(fā)生吻合，性腺發(fā)育更早的雄性胎兒分泌的激素(主要是睪酮和抗繆勒氏激素(anti-mullerian hormone, AMH))通過(guò)血管吻合支抑制雌性胎兒性腺的正常發(fā)育，導(dǎo)致性腺的異常甚至轉(zhuǎn)變[10]。這個(gè)學(xué)說(shuō)在近些年的研究中得到部分印證，例如在5歲異性孿生不育母牛中觀察到支持細(xì)胞持續(xù)分泌AMH、間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在表達(dá)AMH和雄激素的細(xì)胞和卵巢卵泡膜細(xì)胞[11]；此外，在雄性激素環(huán)境中雌性胎兒的闊韌帶(子宮外側(cè)邊緣至骨盆壁)發(fā)育受到抑制[12]，AMH可以介導(dǎo)睪丸的形成[13]。但是激素學(xué)說(shuō)無(wú)法解釋采用激素?zé)o法誘導(dǎo)產(chǎn)生異性孿生不育母牛所有特性的事實(shí)[14]，也沒(méi)有證據(jù)表明雄激素能使卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)椴G丸，雄激素也不能使副中腎管退化，而副中腎管的退化是異性孿生不育母牛內(nèi)生殖解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)之一[15]。

細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為，雌雄胎兒通過(guò)吻合的血管完成細(xì)胞系的融合，雌性胎兒體內(nèi)同時(shí)含有XX和XY兩種性腺細(xì)胞系，形成XX/XY嵌合體[16]；同時(shí)，包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的血液成分在雌雄胎兒間不斷交換，形成血細(xì)胞嵌合體[17]，進(jìn)而抑制雌性個(gè)體后續(xù)生殖系統(tǒng)的發(fā)育。但是，細(xì)胞學(xué)說(shuō)無(wú)法解釋Szczerbal等[18]報(bào)道的5頭異性孿生不育母牛體內(nèi)既不含有異常的染色體核型(60、XX/60、XY)，也不含有Y染色體上的特異性基因。

近些年的觀點(diǎn)認(rèn)為，異性孿生母牛不育并不是簡(jiǎn)單的激素抑制或細(xì)胞嵌合導(dǎo)致的，而是細(xì)胞(造血干細(xì)胞)嵌合和激素(AMH和睪酮)抑制共同作用影響雌性個(gè)體性腺的正常發(fā)育[7]。但是，兩者是如何協(xié)調(diào)作用來(lái)調(diào)控性腺的異常發(fā)育，目前尚無(wú)報(bào)道。

2 異性孿生母牛可育性鑒別方法

從異性孿生不育母?？赡艿男纬蓹C(jī)理出發(fā)，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一系列的鑒別方法。這些方法是建立在正常單生母牛和異性孿生不育母牛在形態(tài)學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、免疫學(xué)以及細(xì)胞分子學(xué)上的差異，主要依據(jù)異性孿生不育母牛的雄性化形態(tài)和內(nèi)分泌激素異常、XX/XY嵌合體。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出臨床檢查、免疫反應(yīng)、激素檢測(cè)、細(xì)胞分系和分子檢測(cè)等鑒別方法，各類鑒別方法列于表1。

表1 異性孿生母?？捎澡b別方法

2.1 臨床檢查

絨毛膜血管是否吻合是臨床檢查的第一步。不管是激素學(xué)說(shuō)還是嵌合學(xué)說(shuō)，造成異性孿生母牛不育的前提是絨毛膜血管要吻合。因此，若在母牛分娩時(shí)雌雄胎兒間的絨毛膜血管吻合，則孿生的母牛判為不育；如果雌雄胎兒間的絨毛膜血管分開(kāi)，那么該雌性個(gè)體鑒別為可育[19]。但是，采用這種方法鑒別的準(zhǔn)確度不高，因?yàn)閷?dǎo)致不育的前提是血管吻合要發(fā)生在雌性胎兒的性別分化前[14]，在這之后發(fā)生吻合引起不育的可能性很低。此外，在妊娠期可能存在雄性胎兒在出生前死亡的情況，這容易忽視雙胎和絨毛膜血管是否吻合的檢查[18]。

陰道長(zhǎng)度測(cè)定是臨床鑒別中最常用的方法。陰道發(fā)育是雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育的重要組成部分；異性孿生母牛由于在胎兒期性腺發(fā)育受到抑制，陰道發(fā)育不完全，陰道長(zhǎng)度偏短是典型的特征[1]，也是容易在體外操作完成的檢測(cè)指標(biāo)。出生1個(gè)月內(nèi)正常母犢的陰道長(zhǎng)度在13～15 cm，而不育母犢的陰道長(zhǎng)度只有5～8 cm；成年正常母牛的陰道長(zhǎng)度約為30 cm，而異性孿生不育母牛的陰道長(zhǎng)度只有8～10 cm[1, 9]。邵陶祺[20]報(bào)道，淘汰出生時(shí)陰道長(zhǎng)度低于8 cm的異性孿生母犢，其鑒別準(zhǔn)確性可達(dá)87%。然而，這種方法在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中雖然簡(jiǎn)單易操作，也會(huì)出現(xiàn)少部分異性孿生母犢出生時(shí)陰道長(zhǎng)度高于8 cm但仍不育的情況[20, 26]。這種方法的準(zhǔn)確性還需要通過(guò)大樣本數(shù)據(jù)來(lái)檢驗(yàn)，因?yàn)殛幍篱L(zhǎng)度的測(cè)定結(jié)果受到測(cè)量物形態(tài)、操作人員和犢牛月齡的影響，而至今仍沒(méi)有統(tǒng)一的測(cè)量工具和陰道長(zhǎng)度隨月齡動(dòng)態(tài)變化的數(shù)據(jù)。

2.2 免疫反應(yīng)

免疫反應(yīng)主要有血型分型和H-Y抗原兩種，都是基于血管吻合后血細(xì)胞或抗原發(fā)生交換的理論。一般而言，異卵雙胎個(gè)體間的血型不一致，當(dāng)雌雄胎盤間的血管發(fā)生吻合后，雌性胎兒就有兩種紅細(xì)胞和兩種紅細(xì)胞抗原。將特定的血型標(biāo)記物加入到待測(cè)樣本中后，若待測(cè)樣本發(fā)生了血管吻合則只會(huì)出現(xiàn)部分的溶血；而當(dāng)待測(cè)樣本沒(méi)有發(fā)生血管吻合時(shí)，則要么不發(fā)生溶血要么全部溶血[21]。然而，這種方法在應(yīng)用過(guò)程中往往不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果，限制因素包括對(duì)溶血程度的判讀以及溶血與否和紅細(xì)胞的處理相關(guān)[10]。此外，該方法僅適用于紅細(xì)胞表面抗原已經(jīng)成熟(通常為1月齡以上)母牛的鑒別[21]，這使得血型分型法無(wú)法用于異性孿生母牛的早期鑒別。

組織相容性抗原Y(histocompatibility antigen Y, H-Y)之前被認(rèn)為是雄性哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面特有的蛋白質(zhì)，由睪丸組織分泌[28]。Wachtel等[22]發(fā)現(xiàn)，卵巢細(xì)胞暴露于雄性或者異性孿生不育雌性胎兒血清后表現(xiàn)為H-Y+陽(yáng)性，而暴露在正常雌性胎兒中則為H-Y-陰性。因此，理論上若待測(cè)樣品的H-Y抗原為陽(yáng)性，則可判定該異性孿生母牛為不育；若為陰性，則可判定為可育。然而，H-Y抗原只是睪丸形成過(guò)程中支持細(xì)胞分泌的產(chǎn)物，并不能決定睪丸是否能夠形成[28]。Qiu等[27]報(bào)道，正常雌性個(gè)體血清中也能檢測(cè)到H-Y抗原的存在，且與異性孿生可育和不育母牛間均沒(méi)有顯著差異。在人類女性的研究中發(fā)現(xiàn)，在XX/XY嵌合和XX真兩性個(gè)體體內(nèi)均能檢測(cè)到H-Y抗原的存在，血液中H-Y抗原的存在不會(huì)抑制卵巢的發(fā)育[29]。以上理論和實(shí)踐應(yīng)用上的數(shù)據(jù)表明，采用H-Y抗原定性或者定量的方法并不能很好地鑒別異性孿生母牛的可育性。

2.3 激素測(cè)定

異性孿生不育母牛的性腺發(fā)育不良，主要表現(xiàn)為卵巢萎縮、陰道和子宮發(fā)育不全及不同程度的雄性化[10]。成年異性孿生不育母牛日常行為也與雄性類似，表現(xiàn)出好斗的特性[11]。從激素學(xué)說(shuō)中的胎兒期發(fā)生激素滲透，結(jié)合異常的性腺發(fā)育和日常行為，推測(cè)內(nèi)分泌激素應(yīng)該和同月齡正常母牛有差異。Libera和Szczerbal[30]在臨床案例中報(bào)道，異性孿生不育母牛的孕酮(小于0.2 ng·mL-1)水平低于正常母牛。然而，Rota等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，正常雄性個(gè)體3月齡 前血漿睪酮含量與同月齡正常雌性個(gè)體、異性孿生不育母牛之間并沒(méi)有顯著差異，只在5月齡后(大于1 ng·mL-1)含量高于后兩者(低于0.4 ng·mL-1)，而正常母牛和異性孿生不育母牛從出生到10月齡均沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異；此外，正常母牛和異性孿生不育母牛在性成熟前的孕酮含量相似(均低于0.4 ng·mL-1)。因此，睪酮和孕酮含量并不能用于早期鑒定，兩者的含量可以作為診斷的輔助指標(biāo)。異性孿生不育母牛血漿中AMH在出生前3 d的含量(大于500 ng·mL-1)高于正常母牛(約90 ng·mL-1)，而在第9天以后，兩者在AMH含量上并無(wú)顯著差異[23]。在山羊中的研究中也發(fā)現(xiàn)，AMH含量容易受到年齡的影響，成年異性孿生不育山羊血清中AMH含量(0.2 ng·mL-1)與正常雄性類似，低于正常雌性(0.6 ng·mL-1)的含量[31]。由此看來(lái)，AMH可用于早期鑒別，但時(shí)間僅限于出生后3 d內(nèi)。然而，由于激素的測(cè)定方法和試劑標(biāo)準(zhǔn)很難一致，采用激素法鑒別時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確將激素濃度區(qū)分值定量；即使是采用同一生理時(shí)期的正常母牛作對(duì)照，采用多大的濃度值差異作為可育性的界限判定仍是難題。

2.4 細(xì)胞分系

雌雄個(gè)體在胎兒期血管吻合后發(fā)生細(xì)胞系的交換，體內(nèi)含有XX和XY兩種細(xì)胞系，這種嵌合的特性不會(huì)隨著年齡消失[10]。通過(guò)培養(yǎng)待測(cè)母牛體組織的白細(xì)胞，鑒定中期細(xì)胞的核型，若同時(shí)存在XX和XY兩種細(xì)胞系則為不育，只存在XX這一種細(xì)胞系則是可育的。在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，并不是所有類型的細(xì)胞都能用作鑒別，對(duì)13月齡異性孿生不育母牛的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)了60, XX和60, XY兩種細(xì)胞系，而在成纖維細(xì)胞中卻只發(fā)現(xiàn)60, XX這一種細(xì)胞系[30]。染色體核型鑒別的準(zhǔn)確性較高，但由于嵌合程度不一樣，對(duì)于XY細(xì)胞數(shù)小于1%的個(gè)體很難準(zhǔn)確檢出[26]。為了提高準(zhǔn)確度就要提高樣本數(shù)量，要達(dá)到95%和99%的置信度，所需的最少細(xì)胞中期數(shù)量分別為26和168[24]，這無(wú)疑增加了時(shí)間和人力成本。同時(shí)，依賴于細(xì)胞培養(yǎng)這項(xiàng)技術(shù)對(duì)樣品和操作的高要求[10]，例如無(wú)菌、運(yùn)輸儲(chǔ)存溫度和保存時(shí)間，這在一定程度上限制了染色體核型檢測(cè)在異性孿生母?？捎澡b別中的廣泛應(yīng)用。

二十世紀(jì)八十年代末發(fā)展起來(lái)的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization, FISH)解決了染色體核型分析所需勞動(dòng)力和時(shí)間成本高的問(wèn)題。Sohn等[17]對(duì)異性孿生母牛血液的中期和間期淋巴細(xì)胞采用牛Y染色體上特異性的DNA探針進(jìn)行熒光原位雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜交結(jié)果與染色體核型分析得出的XY與XX細(xì)胞比例非常相似，說(shuō)明該DNA探針(包含Y染色體上特異性的BC1.2序列)的FISH能用于異性孿生母牛的快速和準(zhǔn)確鑒別。與染色體核型分析相比，F(xiàn)ISH由于使用的是特異性的探針并且是根據(jù)熒光信號(hào)來(lái)判斷結(jié)果，其結(jié)果受人為主觀判斷的影響較小，檢測(cè)速度和重復(fù)性也較高。然而，采用FISH進(jìn)行鑒別的一個(gè)很突出的問(wèn)題是探針的選擇，這關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的可信度，而哪些特異性的染色體序列可以用作FISH的探針仍是需要解決的問(wèn)題[17]。

2.5 分子診斷

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)的快速發(fā)展給性別鑒定帶來(lái)深遠(yuǎn)影響的同時(shí)，也為異性孿生母?？捎缘蔫b別提供了思路。通過(guò)檢測(cè)樣本組織中是否含有Y染色體上的特異性基因或者片段，可以達(dá)到鑒定可育性的目的。目前圍繞這一原理，檢測(cè)的Y染色體上特異性基因主要包括鋅指蛋白Y(ZFY[25])、釉原蛋白Y(AMY[32])、牛Y染色體區(qū)域基因(BRY[33])和Y染色體性別決定基因(SRY[15, 34])。應(yīng)用的技術(shù)包括常規(guī)PCR[33]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[26]、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(real-time quantitative PCR, QPCR)[27, 35]以及微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)[5]，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Y染色體特定片段或基因的定性分析到定量檢測(cè)。

最早應(yīng)用在異性孿生母牛可育性鑒別的分子技術(shù)是常規(guī)PCR。提取全血中的DNA后，采用PCR技術(shù)對(duì)Y染色體上的特異性基因(目標(biāo)基因BRY)和內(nèi)標(biāo)基因(微衛(wèi)星1.709)進(jìn)行擴(kuò)增，若樣本擴(kuò)增后同時(shí)出現(xiàn)目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因產(chǎn)物的條帶，則判定為不育；若只出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)基因條帶，則鑒定為可育。該方法的鑒別靈敏度為2.5%XY細(xì)胞，并可利用在4 ℃ 保存1個(gè)月以上的樣本進(jìn)行檢測(cè)[33]。然而，Qiu等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)PCR在鑒定低嵌合程度異性孿生母?？捎缘倪^(guò)程中容易出現(xiàn)假陰性，僅憑有無(wú)目標(biāo)條帶判斷的準(zhǔn)確性仍需大樣本來(lái)檢驗(yàn)。

LAMP是本世紀(jì)初開(kāi)發(fā)出的一種恒溫?cái)U(kuò)增核酸方法，擴(kuò)增后的特異性DNA產(chǎn)物呈白色沉淀，可通過(guò)渾濁度來(lái)檢測(cè)[36]；該技術(shù)無(wú)需特殊試劑和專門儀器設(shè)備，后續(xù)產(chǎn)物也不需要通過(guò)電泳來(lái)識(shí)別，常用于動(dòng)物胚胎的性別鑒定，目前已開(kāi)發(fā)出便于生產(chǎn)上使用的試劑盒[37]。Hirayama等[26]采用氫氧化鈉堿處理異性孿生母牛外周血的方法獲取DNA后，在63 ℃ 恒溫?cái)U(kuò)增35 min后即可進(jìn)行渾濁度測(cè)量，若渾濁度高于0.20，則判定為嵌合體不育；而當(dāng)渾濁度低于0.20時(shí)，則是非嵌合體的可育；與染色體核型分析和PCR鑒別方法對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，這3種方法的鑒別結(jié)果是一致的，LAMP在檢測(cè)靈敏度(0.01%的XY白細(xì)胞)和操作便捷性(全過(guò)程1 h內(nèi)完成)上分別優(yōu)于染色體核型分析和常規(guī)PCR[26, 37]。

qPCR是在PCR反應(yīng)體系中加入探針或者熒光染料，借助熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控和連續(xù)性分析，不僅可以對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，還可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量和絕對(duì)定量。Artigas等[35]采用qPCR擴(kuò)增牛BRY4基因，獲得特異性的熒光曲線，并通過(guò)待測(cè)樣本是否含有該特征熒光曲線來(lái)判斷不育和可育。Qiu等[27]采用qPCR擴(kuò)增Y染色體上的特異性基因SRY實(shí)現(xiàn)了對(duì)異性孿生母牛體內(nèi)SRY基因含量的相對(duì)定量，該方法在特定儀器上可直接讀取，簡(jiǎn)單易操作且靈敏度高(0.09%)，解決了Mcniel等[32]在使用常規(guī)PCR遇到的無(wú)法檢測(cè)出XY細(xì)胞數(shù)低于0.2%的難題。

ddPCR是第三代PCR，在擴(kuò)增前將樣品進(jìn)行微滴化處理并在擴(kuò)增后對(duì)微滴直接檢測(cè)，該方法突破了傳統(tǒng)擴(kuò)增技術(shù)無(wú)法檢測(cè)低豐度的局限性，相較于qPCR采用閾值和校準(zhǔn)曲線，ddPCR可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品含量的直接定量[5]。目前，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)用于豬[38]和牛[5]異性孿生雌性個(gè)體可育性的鑒定。采用ddPCR技術(shù)對(duì)牛AMX和AMY擴(kuò)增試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法可檢測(cè)到低至3%的細(xì)胞系；該方法快速可靠，成本約為細(xì)胞檢測(cè)的1/4[5]。

以上鑒別方法中，沒(méi)有一種能兼具準(zhǔn)確性和低成本。筆者推薦的檢測(cè)程序是外部臨床檢查(簡(jiǎn)單成本低)與分子檢測(cè)(準(zhǔn)確性高)結(jié)合，即根據(jù)出生時(shí)絨毛膜血管是否吻合和陰道長(zhǎng)度進(jìn)行初步篩選，對(duì)于不確定的個(gè)體，采集血液返回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子水平上的進(jìn)一步診斷。

3 異性孿生不育母牛的利用

3.1 種用或育肥

經(jīng)過(guò)鑒別認(rèn)定為可育的母?？梢粤麴B(yǎng)當(dāng)作后備母牛飼養(yǎng)，但可育母牛的繁殖性能和生產(chǎn)性能以及后代特性仍缺乏數(shù)據(jù)；鑒定為不可育的異性孿生母?？芍苯犹蕴蛘弋?dāng)作肉牛飼養(yǎng)。目前，探究不可育異性孿生母牛育肥特性的研究較少。He等[39]對(duì)異性孿生不育母牛在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和代謝上的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充長(zhǎng)鏈脂肪酸鈣鹽可以提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率和血漿膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇濃度并減少氮留存，補(bǔ)充苜蓿會(huì)對(duì)瘤胃發(fā)酵和部分瘤胃微生物的組成造成影響。國(guó)外研究表明，異性孿生不育母牛在生長(zhǎng)和胴體性能上類似甚至優(yōu)于單生和雙生正常母牛，例如，育肥全期的日增重與正常雙生牛沒(méi)有顯著差異(843 g·d-1vs.838 g·d-1)，而初生重(37.6 kg)高于正常雙生牛(35.2 kg)，大理石花紋評(píng)分(6.30vs.5.47)和牛肉產(chǎn)量等級(jí)(2.57vs.2.17)均高于正常雙生牛[40]。Parker等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，異性孿生不育母牛和同性孿生母牛的生長(zhǎng)性能和胴體特性類似，但在大理石花紋評(píng)分上前者有高于后者的趨勢(shì)。雖然在各個(gè)生長(zhǎng)育肥階段單生牛的活體重、干物質(zhì)采食量和每公斤增重成本要高于雙胎牛，但是在增長(zhǎng)速度上兩者并無(wú)顯著差異[42]。

3.2 動(dòng)物模型

3.2.1 器官移植 異性孿生是一種獨(dú)特的自然聯(lián)體共生，異性孿生母牛的存在為繁殖生物學(xué)、移植生物學(xué)和自身免疫疾病的耐受性提供了研究模型[43]。自1945年Owen[44]發(fā)現(xiàn)異性孿生公牛和母牛間的血管吻合并且存在紅細(xì)胞嵌合后，采用造血干細(xì)胞嵌合誘導(dǎo)產(chǎn)生獲得性免疫耐受能力的思路就應(yīng)用在器官移植中。目前，已廣泛應(yīng)用在實(shí)體器官移植上的耐受性有操作耐受性和刪除耐受性，前者是在沒(méi)有產(chǎn)生嵌合的情況能穩(wěn)定產(chǎn)生1年以上的免疫抑制耐受性，后者為需要持續(xù)的供體造血細(xì)胞作為抗原來(lái)源的耐受性[45]。異性孿生母牛嵌合性提供的是刪除耐受性的思路，然而，在人主要組織相容性復(fù)合體中誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)的嵌合很困難，主要是因?yàn)橐胪ㄟ^(guò)嵌合誘導(dǎo)耐受性不僅需要多血統(tǒng)血液同時(shí)嵌合和長(zhǎng)期的外周調(diào)節(jié)機(jī)制，還存在著器官的特異性，目前表現(xiàn)為腎和肺可行，但心的移植耐受不可行[46]。為此，Oura等[46]提出，通過(guò)瞬時(shí)混合的嵌合方法來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)誘發(fā)移植物抗宿主病。利用異性孿生這種體內(nèi)耐受性還可以通過(guò)囊胚互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)完整器官在受體內(nèi)的生成，這要求供體多能干細(xì)胞在胚胎植入前就遷移到受體宿主內(nèi)，利用嵌合體強(qiáng)大的生成能力發(fā)育成供體的目標(biāo)器官[47]。

3.2.2 性腺發(fā)育 異性孿生胎兒血管吻合后同時(shí)在相同或者類似激素水平刺激下發(fā)育，這種自然狀態(tài)下的激素-神經(jīng)-性腺發(fā)育調(diào)控系統(tǒng)可以作為研究腦調(diào)控性別分化的動(dòng)物模型[48-49]。Gra?c等[49]的研究發(fā)現(xiàn)，異性孿生不育母牛下丘腦視交叉上核比雄性大32.5%，而加壓素和含有催產(chǎn)素的神經(jīng)核介于正常雄性和雌性之間，這說(shuō)明雄性激素對(duì)大腦的發(fā)育在胎兒期就存在組織效應(yīng)。目前，Corain等[48]已開(kāi)發(fā)出計(jì)量分析小腦細(xì)胞形態(tài)的方法，并將該方法應(yīng)用于正常公牛和母牛及異性孿生母牛來(lái)研究性別二態(tài)性。Montelli等[50]報(bào)道，與同年齡的公牛相比，異性孿生不育母牛小腦中的顆粒細(xì)胞形態(tài)值更大。Rizzo等[51]發(fā)現(xiàn)，α-甲胎蛋白不與睪酮結(jié)合，可直接跨越血腦屏障影響下丘腦的發(fā)育和調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響性別分化。這部分研究表明，異性孿生母牛性腺異常發(fā)育是激素和神經(jīng)綜合調(diào)控的結(jié)果，可以將異性孿生母牛作為研究激素通過(guò)神經(jīng)影響性腺發(fā)育機(jī)理的動(dòng)物模型。

3.2.3 雙胎輸血綜合征 雙胎輸血綜合征是人類多胎妊娠中一個(gè)極具挑戰(zhàn)的臨床問(wèn)題，在單絨毛膜雙羊膜囊妊娠中的發(fā)病率為10%～20%，出現(xiàn)該問(wèn)題如果不加以治療，死亡率高達(dá)80%～100%[52-54]。該癥狀是由于胎盤血管吻合后胎兒間血流發(fā)展不平衡導(dǎo)致其中一個(gè)胎兒的血液過(guò)多地流向了另外一個(gè)胎兒，造成器官衰竭甚至死亡[1,55-56]。而在異性孿生母牛中，雌雄胎兒間的血流在血管吻合的情況下依然發(fā)展平衡。在人類的異性雙胎中，含有46, XX/46, XY嵌合體的女性個(gè)體卻沒(méi)有表現(xiàn)出像異性孿生不育母牛那樣的異常性腺器官和不育性[57]。以上現(xiàn)象說(shuō)明，牛和人的雙胎間發(fā)生血管吻合后帶來(lái)的致病效應(yīng)不一樣，這可能是血管吻合類型、時(shí)間和強(qiáng)度不同所導(dǎo)致的，對(duì)異性孿生母牛血管吻合機(jī)制的深入研究有助于為雙胎輸血綜合征的預(yù)防和治療提供思路。

4 未來(lái)研究方向與展望

異性孿生母牛可育性的鑒別方法逐步準(zhǔn)確、高效和早期化，這與高速發(fā)展的細(xì)胞分子技術(shù)和對(duì)異性孿生這種現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)不斷加強(qiáng)密切相關(guān)。從最初的臨床經(jīng)驗(yàn)檢查到細(xì)胞培養(yǎng)和內(nèi)分泌激素檢測(cè)，再到二十世紀(jì)末的分子擴(kuò)增以及二十一世紀(jì)新發(fā)展起來(lái)的分子雜交及新一代擴(kuò)增技術(shù)，見(jiàn)證了鑒別過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)判斷、定性分析和定量檢測(cè)的發(fā)展，同時(shí)也推動(dòng)著人們對(duì)這一現(xiàn)象認(rèn)識(shí)的加深和應(yīng)用。筆者認(rèn)為，在今后，有3大有潛力的研究方向。

一是異性孿生不育母牛激素水平和嵌合程度以及雄性化程度的關(guān)聯(lián)性分析。圍繞目前較為成熟的激素學(xué)說(shuō)和嵌合學(xué)說(shuō)，仍存在需要進(jìn)一步解釋的問(wèn)題。Remnant等[11]在成年母牛中發(fā)現(xiàn)黃體但沒(méi)有可見(jiàn)的卵泡或卵母細(xì)胞，AMH的存在會(huì)影響子宮的正常發(fā)育和卵泡的形成；同時(shí)，本世紀(jì)初已有理論提出，異常嚴(yán)重程度與雌雄胎兒間的血管吻合程度、暴露在激素中的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間相關(guān)[12]，但是激素通過(guò)怎樣的調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致了雌性個(gè)體不同程度的雄性化，以及通過(guò)激素調(diào)控后的雄性化與細(xì)胞學(xué)說(shuō)中的嵌合程度之間的關(guān)聯(lián)性仍需要進(jìn)一步明晰。許多報(bào)道發(fā)現(xiàn)，異性孿生母牛的嵌合比例從0%到96%不等[5, 58]，并且遷移過(guò)去的細(xì)胞異常頻率增加[58]。Ciotola等[59]在探究染色體脆性的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，異性孿生不育母牛的非整倍性細(xì)胞比例和染色單體斷裂均顯著高于單生正常的公?；蛘吣概?，Kochneva等[58]在異性孿生母牛中也觀察到了類似的X染色體脆性增強(qiáng)現(xiàn)象。然而，XX/XY比例和雄性化程度無(wú)關(guān)[7]，這使得通過(guò)細(xì)胞手段檢測(cè)的染色體嵌合比例和分子手段檢測(cè)的基因嵌合率都不能與雄性化直接關(guān)聯(lián)起來(lái)。

二是從嵌合組織和嵌合時(shí)間結(jié)合細(xì)胞分子學(xué)以及內(nèi)分泌學(xué)認(rèn)識(shí)嵌合的本質(zhì)。Young和Kirkpatrick[60]的研究發(fā)現(xiàn)，血液淋巴細(xì)胞嵌合的特性不會(huì)隨著年齡改變，雌雄胎兒間嵌合關(guān)聯(lián)性與嵌合程度相關(guān)：當(dāng)交換比例高于45%時(shí)，雌雄胎兒間的嵌合比例呈顯著負(fù)相關(guān)；而當(dāng)交換比例小于45%時(shí)，雌雄胎兒間嵌合比例沒(méi)有顯著相關(guān)性。Biswas等[61]在四胞胎(組成為3雌性和1雄性)中發(fā)現(xiàn)，胎兒間均存在嵌合且嵌合的比例(均低于15%)類似，這說(shuō)明嵌合比例與胎兒中的性別組成相關(guān)。異性孿生母牛的嵌合只發(fā)生在局部組織，并不是全身性的嵌合，目前在牛的血液[13]和鼻黏膜[62]中均能檢測(cè)到XX/XY嵌合體的存在，在毛囊和皮膚中卻無(wú)法檢測(cè)到嵌合體[13, 60]。Torres等[63]的研究發(fā)現(xiàn)，異性孿生胎兒在胚胎發(fā)育過(guò)程中，基因交換會(huì)發(fā)生在生殖結(jié)節(jié)。以上研究均是針對(duì)特定組織在特定生理時(shí)期得出的嵌合特性，同一組織在不同時(shí)間或者不同組織在同一時(shí)間的嵌合特性目前仍不清楚。因此，有必要比較不同組織在不同時(shí)期的嵌合程度，來(lái)確定能用于早期快速準(zhǔn)確鑒別的組織，同時(shí)也可以結(jié)合細(xì)胞和分子手段進(jìn)一步認(rèn)識(shí)嵌合的本質(zhì)和可能的途徑。

三是異性孿生可育母?？梢宰鳛槊庖吣褪苄匝芯康膭?dòng)物模型。異性孿生母牛中仍有5%～15%具備繁殖能力，Qiu等[27]報(bào)道了2頭異性孿生可育母牛體內(nèi)仍有較低的SRY含量，嵌合程度和繁殖能力之間的關(guān)聯(lián)性仍需要深入探究。此外，這部分可育母牛具有的免疫耐受性預(yù)示著機(jī)體內(nèi)有一套強(qiáng)大的抵御機(jī)制，揭示可育的這部分異性孿生母牛的耐受機(jī)制有助于人體免疫移植和雙胎輸血綜合征的預(yù)防和治療。