李云云 劉萌 張雪梅 薛小臨 楊琳 嚴(yán)干新

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí),體內(nèi)活性氧生成與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打亂,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基產(chǎn)生過多和/或清除能力降低,氧化程度超出了氧化物的清除能力,從而導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,致機(jī)體發(fā)生一系列氧化損傷[1]。其中,ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)、過氧化氫(H2O2)等。H2O2活性較低,是一種非自由基類物質(zhì),有相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期,性質(zhì)比較穩(wěn)定,組織中作用范圍廣泛,可以允許其擴(kuò)散至細(xì)胞膜,因此H2O2被廣泛用于氧化應(yīng)激的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中。氧化應(yīng)激時(shí)過量產(chǎn)生的ROS可通過活化絲/蘇氨酸激酶-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ?qū)蝹€(gè)心室肌細(xì)胞多種離子通道、泵、轉(zhuǎn)運(yùn)體、鈣周期調(diào)控蛋白及縫隙連接蛋白等進(jìn)行磷酸化修飾從而引起心肌細(xì)胞電活動(dòng)紊亂,被認(rèn)為是誘發(fā)病變心臟發(fā)生室性心律失常的可能的潛在的共同機(jī)制[2－5]。目前,氧化應(yīng)激對(duì)心肌組織電活動(dòng)影響的相關(guān)報(bào)道較少,因此筆者以冠狀動(dòng)脈灌注兔左室楔形組織塊標(biāo)本為研究對(duì)象[6],從組織水平上觀察H2O2對(duì)兔離體左室復(fù)極相關(guān)電生理指標(biāo)及心律失常的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 臺(tái)氏液(mmol/L)：NaCl 129、KCl 4、CaCl21.8、Na H2PO4·2 H2O 0.9、MgSO4·7H2O 0.5、Na HCO320、C6H12O6·H2O 5.5。高鉀臺(tái)氏液(mmol/L)：KCl 24,余成份同臺(tái)式液。上述液體均現(xiàn)用現(xiàn)配；過氧化氫(H2O2)購于美國(guó)Sigma公司。

1.2 冠狀動(dòng)脈(簡(jiǎn)稱冠脈)灌注兔左室楔形標(biāo)本制備 成年家兔,體重2.2～2.8 kg,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。經(jīng)兔耳緣靜脈注射肝素抗凝后給予30%的烏拉坦(5 ml/kg)進(jìn)行麻醉,開胸取出心臟,放入4℃高鉀臺(tái)氏液中。經(jīng)左側(cè)冠脈開口,插入冠脈插管至回旋支,固定插管后,灌注低溫高鉀臺(tái)氏液,以去除冠脈內(nèi)殘留血液并使心臟停跳。修剪標(biāo)本,制備左室楔形組織塊,其標(biāo)本寬約1.5～2.0 cm,長(zhǎng)約2～3 cm標(biāo)本。將標(biāo)本放入恒溫浴槽內(nèi),改用臺(tái)氏液灌流,臺(tái)式液溫度維持在35.7±0.1℃,灌注壓維持在35～45 mm Hg,持續(xù)向臺(tái)式液中輸入95%O2和5%CO2的混合氣。起搏電極放置于心尖部?jī)?nèi)膜側(cè),給予約1 h頻率為1 000 ms基礎(chǔ)刺激,待穩(wěn)定后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及刺激流程 本實(shí)驗(yàn)為同一標(biāo)本前后對(duì)照,首先給予標(biāo)本灌注臺(tái)式液及周長(zhǎng)為1 000 ms基礎(chǔ)刺激(basic cycle length,BCL)穩(wěn)定1 h,之后繼續(xù)灌注臺(tái)式液,且給予相應(yīng)程序電刺激(對(duì)照組,n＝12),刺激周長(zhǎng)依次為2 000、1 000、500 ms,時(shí)間依次為7、1、0.5 min。待心電生理指標(biāo)穩(wěn)定(QT間期5 min內(nèi)變化小于4 ms)后,再持續(xù)灌注1.0 mmol/L H2O2的臺(tái)式液,且給予相應(yīng)程序電刺激(實(shí)驗(yàn)組,n＝12),刺激周長(zhǎng)和時(shí)間同對(duì)照組。

1.4 電生理指標(biāo)記錄與測(cè)量 跨壁心電圖(ECG)的記錄：將銀-氯化銀電極放置入臺(tái)氏液中,電極的正極位于標(biāo)本的外膜側(cè),負(fù)極位于標(biāo)本內(nèi)膜側(cè)(與正常的跨膜心電向量方向相一致),距離心室組織塊內(nèi)(Endo)、外(Epi)膜側(cè)約1.0～1.5 cm處。心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位(action potential,AP)的記錄：用浮置玻璃微電極記錄內(nèi)外膜側(cè)心肌細(xì)胞的AP。測(cè)量指標(biāo)包括復(fù)極及跨壁復(fù)極離散度相關(guān)指標(biāo),QT間期為心電圖上從QRS波開始至T波下降支與等電位線交匯處的時(shí)間間期；Tp-e(Tpeak-Tend)間期為T波頂點(diǎn)(Tpeak)到T波終點(diǎn)(Tend)(下降支與等電位線交匯處)的時(shí)間間期；Tp-e/QT為校正的Tp-e；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT比值的差值記錄為ΔQT、ΔTp-e、ΔTp-e/QT；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT比值的變化百分比記錄為ΔQT%、ΔTp-e%、ΔTp-e/QT%；同時(shí)還記錄2 000 ms刺激下心內(nèi)膜(Endo)及心外膜(Epi)早后除極(early after depolarization,EAD),晚后除極(delayed after depolarization,DAD)及體表心電圖R-on-T室性早搏(簡(jiǎn)稱室早)(頻發(fā)為大于6次/分,偶發(fā)為小于6次/分)、室性心動(dòng)過速(簡(jiǎn)稱室速)及心室顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱室顫)等心律失常。

1.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在不同BCL條件下,各電生理指標(biāo)采取重復(fù)測(cè)量資料方差分析,組內(nèi)比較采用自身前后配對(duì)t檢驗(yàn),率的比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)的Fisher′s確切概率法。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同BCL刺激時(shí)兩組電生理指標(biāo)比較 兩組QT間期、Tp-e間期均隨BCL的增加而延長(zhǎng)。然而,實(shí)驗(yàn)組的慢頻率依賴性更加顯著(圖1、表1)。2 000 ms BCL刺激下與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組QT間期、Tp-e間期明顯延長(zhǎng)。

表1 兩組QT間期、Tp－e間期隨不同基礎(chǔ)刺激周長(zhǎng)(BCL)的變化(n＝12)

圖1 不同BCL刺激下兩組QT間期、Tp-e間期的比較(n＝12)

2.2 2 000 ms BCL刺激下兩組電生理指標(biāo)比較2 000 ms BCL刺激下,對(duì)照組Tp-e/QT隨時(shí)間無明顯變化,實(shí)驗(yàn)組隨H2O2作用時(shí)間延長(zhǎng)Tp-e/QT比值呈先增大后減小的變化趨勢(shì),其值始終大于對(duì)照組,具體表現(xiàn)為：從H2O2充分作用開始,8 min時(shí)達(dá)效應(yīng)峰值,Tp-e和QT間期同時(shí)延長(zhǎng)且ΔTp-e%較ΔQT%增加顯著,致Tp-e/QT比值隨時(shí)間增大；繼續(xù)延長(zhǎng)觀察時(shí)間,Tp-e和QT間期同時(shí)縮短且ΔTp-e%較ΔQT%下降顯著,致Tpe/QT比值減小,但在觀察時(shí)間內(nèi)始終大于對(duì)照組(圖2、表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)組在2 000 ms BCL刺激下復(fù)極相關(guān)電生理指標(biāo)隨時(shí)間的變化(n＝8)

圖2 實(shí)驗(yàn)組在2 000 ms BCL刺激下QT間期、Tp-e間期時(shí)間依賴性變化(n＝8)

2.3 兩組發(fā)生EAD、DAD以及室性心律失常的比較 實(shí)驗(yàn)共12例標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)組有8例標(biāo)本在2 000 ms BCL刺激下發(fā)生室性心律失常(vs對(duì)照組,n＝12,P＜0.001),其中6例發(fā)生EAD(2例頻發(fā)、4例偶發(fā))以及R-on-T室早,無室速及室顫發(fā)生(圖3),其余2例頻發(fā)EAD及R-on-T室早,并發(fā)生R-on-T室早觸發(fā)的多形性室速及室顫(圖4),實(shí)驗(yàn)過程中伴明顯T波下降支切跡。對(duì)照組在相同的刺激條件下未觀察到EAD、DAD及R-on-T室早、室速及室顫現(xiàn)象。

圖3 2 000 ms BCL刺激下EAD、DAD及單次觸發(fā)激動(dòng)

3 討論

氧化應(yīng)激對(duì)心血管疾病的影響及其機(jī)制日益受到人們的廣泛關(guān)注,其嚴(yán)重影響著高血壓、心肌缺血/再灌注損傷、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[7－8]。筆者實(shí)驗(yàn)通過灌注H2O2觀察氧化應(yīng)激對(duì)離體兔左室心電圖QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT等復(fù)極相關(guān)電生理指標(biāo)的影響,并通過浮置玻璃微電極同步記錄內(nèi)外膜側(cè)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位,探索H2O2與復(fù)極相關(guān)室性心律失常發(fā)生的可能的內(nèi)在關(guān)系。

筆者利用H2O2刺激模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激,發(fā)現(xiàn)H2O2可引起心電圖QT間期、Tp-e間期延長(zhǎng),Tpe/QT增大,且呈現(xiàn)顯著的慢頻率依賴性,即就是心率減慢時(shí)這種變化特點(diǎn)更加顯著。此外,實(shí)驗(yàn)同步觀察到APD較長(zhǎng)的內(nèi)膜側(cè)心肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng)顯著,2相平臺(tái)期延長(zhǎng),復(fù)極易損窗增大,易誘發(fā)EAD及觸發(fā)激動(dòng)并向APD較短的外膜側(cè)傳導(dǎo),進(jìn)而利于跨室壁折返的產(chǎn)生和維持,從而促進(jìn)心律失常發(fā)生。本結(jié)果提示：氧化應(yīng)激狀態(tài)合并慢心室率,內(nèi)膜側(cè)EAD觸發(fā)機(jī)制可能是心律失常發(fā)生的啟動(dòng)因素,跨心室壁折返機(jī)制則可能是心律失常得以維持的關(guān)鍵。

有報(bào)道[9],氧化應(yīng)激可引起心肌電-機(jī)械損傷,晚鈉電流增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)鈣超載,ATP-敏感性鉀通道活化可能與該過程有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)灌注H2O2條件下觀察到,慢頻率刺激時(shí)跨壁復(fù)極異質(zhì)性的電生理指標(biāo)有先增大后減小的時(shí)間依賴性影響,其表現(xiàn)可分為三個(gè)階段：隨H2O2作用時(shí)間延長(zhǎng)QT間期延長(zhǎng)、T波降支延緩伴切跡,同步記錄單個(gè)心室肌細(xì)胞AP延長(zhǎng)伴EAD、DAD及后收縮發(fā)生。繼之QT間期縮短。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)延長(zhǎng)觀察時(shí)間,心肌細(xì)胞興奮性喪失：細(xì)胞喪失興奮性可能是由于隨細(xì)胞外鉀離子濃度升高達(dá)一定程度,靜息電位減小到一定程度,進(jìn)入失活的鈉通道逐漸增多,閾電位會(huì)上移,使靜息電位與閾電位的差值增大,興奮閾值升高,細(xì)胞興奮性降低達(dá)一定程度興奮性喪失。本實(shí)驗(yàn)同步觀察了跨壁心電圖、心肌細(xì)胞動(dòng)作電位形態(tài)時(shí)程的變化,若能同時(shí)增加對(duì)心肌收縮力及細(xì)胞Ca2＋瞬變的觀察,對(duì)探索氧化應(yīng)激時(shí)心肌電-機(jī)械活動(dòng)變化的內(nèi)在機(jī)制能提供更有利的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

總之,心血管病理狀態(tài),氧化應(yīng)激水平升高,心電圖QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT等無創(chuàng)性復(fù)極相關(guān)電生理指標(biāo)呈慢頻率依賴性變化,跨心室壁復(fù)極離散度增大,復(fù)極相關(guān)室性心律失常發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。本實(shí)驗(yàn)提示臨床工作中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)心電圖復(fù)極相關(guān)電生理指標(biāo)的嚴(yán)密觀察分析,可及早預(yù)測(cè)慢頻率或間歇依賴的復(fù)極相關(guān)心律失常發(fā)生,以便有效措施及時(shí)干預(yù),從而降低心血管惡性事件風(fēng)險(xiǎn)及不可逆性損傷。