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        鈉?鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究進展

        2021-06-30 01:22:16付旭陽孫健淇呂軍石瑞麗

        付旭陽 孫健淇 呂軍 石瑞麗

        鈉?鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1(NKCC1)作為人體內(nèi)的重要離子轉(zhuǎn)運體,主要介導(dǎo)鈉、鉀、氯等離子由細胞外向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,對氯離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控發(fā)揮重要作用。NKCC1存在多個磷酸化位點和啟動子甲基化位點,與其表達與活性調(diào)控密切相關(guān),在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中均能觀察到NKCC1的異常變化[1]。布美他尼作為NKCC1特異性抑制劑,可用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療,如低劑量布美他尼用于治療小兒孤獨癥,可改善社交、互動和興趣受限行為[2];針對動物缺血?再灌注腦損傷模型的研究顯示,布美他尼還可通過抑制NKCC1活性而發(fā)揮腦保護作用[3]?;诖?,本文擬綜述NKCC1的最新研究進展并分析將NKCC1作為治療靶點治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能性,為疾病防治提供新的研究思路。

        一、NKCC1的結(jié)構(gòu)與功能

        1.NKCC1結(jié)構(gòu) 鈉?鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NKCCs)屬于Slc12a家族,該家族包含數(shù)個基因,如編碼NKCC2的Slc12a1基因、編碼NKCC1的Slc12a2基因、編碼鈉?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NCC)的Slc12a3基因、編碼鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(KCC)1~4的Slc12a4?7基因等[4]。人類NKCC1共包含1212個氨基酸殘基,轉(zhuǎn)錄本為7.4 kb,相對分子質(zhì)量131.4×103,其編碼基因位于第5號染色體[5]。NKCC1擁有較大的氨基端(N端)和羧基端(C端),N端大部分無序,包含調(diào)控區(qū)域,其中的氨基酸磷酸化狀態(tài)決定了NKCC1的生物活性,不同物種的NKCC1蛋白N端具有序列多樣性[6]。人類細胞試驗顯示,NKCC1蛋白的N端具有糖基化修飾,約25%的NKCC1蛋白N端為復(fù)雜型N?糖基化,其余75%的NKCC1蛋白N端為高甘露糖糖基化和混合糖基化[7]。NKCC1蛋白經(jīng)翻譯修飾后,約10%到達質(zhì)膜,且大部分為高甘露糖型,其余90%的NKCC1蛋白分布在細胞內(nèi),其N端糖基化在NKCC1的協(xié)同轉(zhuǎn)運功能中發(fā)揮重要作用,但尚無證據(jù)表明糖基化與蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位有關(guān)[7]。NKCC1蛋白C端高度保守且與陽離子?氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白家族呈高度同源,其作用目前尚不明確,期待未來進行深入研究探討。

        2.NKCC1功能 NKCC1表達廣泛,除外分泌上皮細胞,其在心臟、骨骼肌神經(jīng)元等非分泌上皮細胞中也有分布。既往研究證明,NKCC1表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的全腦神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、脈絡(luò)叢上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元[4];而近期有研究發(fā)現(xiàn),腦卒中、膠質(zhì)細胞瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病亦可導(dǎo)致NKCC1表達異常[1,8],同時NKCC1還參與不同組織細胞的離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞體積和質(zhì)量調(diào)節(jié),以及神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等正常生理功能[9]。正常情況下,Na+?K+?ATP酶提供能量并將鈉離子和鉀離子轉(zhuǎn)運至細胞外,而NKCC1以繼發(fā)主動轉(zhuǎn)運的方式消耗能量進行離子跨膜轉(zhuǎn)運,介導(dǎo)鈉、鉀、氯離子向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)[9]。研究顯示,NKCC1通過離子轉(zhuǎn)運方式改變細胞滲透壓,調(diào)節(jié)細胞體積,在高滲環(huán)境下,細胞失水皺縮需觸發(fā)適當?shù)恼{(diào)節(jié)機制以增大細胞體積,此時NKCC1被激活,介導(dǎo)離子向細胞內(nèi)泵入,完成細胞體積的調(diào)節(jié);當細胞處于低滲狀態(tài)時,細胞吸水膨脹,NKCC1呈低活性狀態(tài),相反,KCC2被激活,介導(dǎo)鉀離子和氯離子外流,滲透壓降低,水分子隨之流出細胞,恢復(fù)細胞體積[10]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1(mTOR1)受上游的生長因子和必需氨基酸調(diào)控,調(diào)節(jié)細胞生長[11],近期研究發(fā)現(xiàn)[12]NKCC1對L型氨基酸轉(zhuǎn)運載體1(LAT1)和細胞表面抗原4F2重鏈(4F2hc)所形成的LAT1?4F2hc復(fù)合體發(fā)揮負調(diào)控作用,其在調(diào)控LAT1的同時降低mTOR1活性,通過此途徑參與細胞的生長調(diào)節(jié)。γ?氨基丁酸(GABA)是重要的抑制性中樞神經(jīng)遞質(zhì),其受體為離子門控通道,當該通道被激活時,氯離子可由此流出或流入細胞。在正常生理狀態(tài)下,成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)KCC2呈高表達、NKCC1呈低表達[4],當氯離子細胞內(nèi)濃度低于細胞外時,GABA受體被激活,氯離子內(nèi)流,細胞超極化;而在病理狀態(tài)下,NKCC1表達升高,氯離子轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi),細胞內(nèi)氯離子濃度升高,此時若GABA受體被激活,反使氯離子內(nèi)流減少、胞膜超極化水平降低,甚至發(fā)生氯離子外流、細胞去極化[13]。上述研究提示,NKCC1可通過調(diào)控細胞內(nèi)氯離子濃度,改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA的生物學效應(yīng)。不同神經(jīng)元中NKCC1的作用有所不同,例如在視交叉上核中,大部分神經(jīng)元可產(chǎn)生GABA作為神經(jīng)元之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號,GABA亦可使大部分神經(jīng)元產(chǎn)生抑制性電位[14],但有研究顯示,視交叉上核背側(cè)和腹側(cè)的GABA可以產(chǎn)生興奮性電位,并且這種興奮性作用可被NKCC1抑制劑布美他尼所阻斷[15]。總結(jié)上述兩項研究可以發(fā)現(xiàn),GABA興奮和抑制電位的產(chǎn)生系由NKCC1功能狀態(tài)所決定的,NKCC1活躍時,氯離子濃度升高、產(chǎn)生興奮性電位,反之,則產(chǎn)生抑制性電位,提示這兩種不同的電位與NKCC1所介導(dǎo)的不同的細胞內(nèi)氯離子濃度變化有關(guān)。晚近研究顯示,NKCC1表達受視交叉上核內(nèi)環(huán)境光照調(diào)控[16],NKCC1 mRNA在視網(wǎng)膜色素上皮細胞亦存在節(jié)律性表達,NKCC1表達量的改變可導(dǎo)致GABA產(chǎn)生不同的生物學效應(yīng),進而參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[17]。

        二、NKCC1表達與活性的調(diào)控

        NKCC1在人類胎兒期呈高表達,KCC2呈低表達,隨著年齡的增長,NKCC1表達逐漸降低,KCC2表達逐漸升高,使GABA介導(dǎo)的神經(jīng)元離子電化學反應(yīng)由超極化向去極化轉(zhuǎn)變[18]。研究顯示,在胎兒成長過程中其體內(nèi)的NKCC1活性隨著母體循環(huán)中催產(chǎn)素水平的增加而逐漸降低,使GABA能信號產(chǎn)生抑制性電位,后者在分娩過程中產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護作用可幫助胎兒適應(yīng)分娩時的不良刺激,此為胎兒抗神經(jīng)損傷的一種生理學機制[19]。而在病理或特定環(huán)境下,NKCC1的表達會因蛋白質(zhì)磷酸化、DNA甲基化或炎性細胞因子刺激等因素的影響而發(fā)生改變[20?22]。

        1.NKCC1的表達調(diào)節(jié) 研究顯示,轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白2(STAT2)的可結(jié)合位點位于NKCC1轉(zhuǎn)錄起始點上游的30和500 bp處[23],但有關(guān)STAT2對NKCC1表達變化的影響至今尚不十分清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學機制之一,由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化完成。DNA高甲基化與基因轉(zhuǎn)錄阻遏相關(guān),DNA低甲基化可促進基因轉(zhuǎn)錄。在正常情況下,大鼠Slc12a啟動子甲基化水平隨其月齡的增加而逐漸升高,隨著DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的增強,可使NKCC1的表達維持在低水平狀態(tài);而自發(fā)性高血壓模型大鼠體內(nèi)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性則隨其月齡的增加而呈逐漸衰減趨勢,Slc12a基因啟動子呈低甲基化水平,這可能是NKCC1在自發(fā)性高血壓人群中呈高表達的重要病生 理 學 機制[24]。Unal等[25]發(fā)現(xiàn),與 健 康 對 照組 相比,顳葉癲 患者病灶組織中NKCC1甲基化水平表達異常,提示NKCC1可能通過甲基化改變其表達量,從而參與難治性顳葉癲 的發(fā)病過程。Lee等[1]采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5?azadC處理正常大鼠皮質(zhì)組織切片,發(fā)現(xiàn)5?azad C可顯著提高NKCC1的表達;對大腦中動脈閉塞(MCAO)缺血大鼠模型的觀察亦發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷大鼠皮質(zhì)NKCC1相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均升高,且患側(cè)大腦皮質(zhì)Slc12a外顯子1區(qū)DNA甲基化程度明顯低于健側(cè),推測與NKCC1 mRNA及其蛋白質(zhì)重新表達有關(guān)。該研究結(jié)果提示,DNA甲基化參與對NKCC1表達的調(diào)控。除此之外,一些炎性因子亦與NKCC1的表達變化存在一定關(guān)聯(lián)性。Weidenfeld和Kuebler[26]發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子?α(TNF?α)等炎性因子可上調(diào)急性肺損傷模型小鼠NKCC1的表達水平,TNF?α缺陷模型小鼠小腦及大腦皮質(zhì)NKCC1表達均降低,注射TNF?α后其NKCC1表達顯著升高[27],提示TNF?α具有促進NKCC1表達的作用。原代星形膠質(zhì)細胞實驗顯示,TNF?α或白細胞介素?1β(IL?1β)可顯著增加NKCC1相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)的表達,并可隨其體內(nèi)濃度的降低而下調(diào)[28]。但上述研究仍不能明確炎性因子激活NKCC1表達的作用是否具有特異性,其他細胞因子是否也參與炎性損傷時對NKCC1表達的調(diào)節(jié)。

        2.NKCC1的活性調(diào)節(jié) 1992年,Lytle和Forbush[29]首次報告NKCC1磷酸化對其功能的影響:NKCC1抑制劑布美他尼注射于經(jīng)高滲溶液皺縮的鯊魚直腸腺細胞內(nèi)即可見細胞內(nèi)鉀離子濃度迅速升高,該作者認為細胞內(nèi)鉀離子濃度的變化與NKCC1蛋白中絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化有關(guān)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),NKCCs家族的生物活性與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(WNK)、STE20/SPS?1相關(guān)性脯氨酸?丙氨酸激酶(Spak)和氧化應(yīng)激反應(yīng)激酶(OSR1)磷酸化有關(guān)。與正常小鼠相比,Spak基因敲除小鼠感覺神經(jīng)元NKCC1活性下降2倍,表明Spak參與了NKCC1的活化過程[30]。WNK3激活NKCC1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路需Spak/OSR1的參與,Spak/OSR1與WNK3在其Thr233和Thr185兩個氨基酸位點結(jié)合,通過已磷酸化的WNK3 T環(huán)激活Spak/OSR1,活化的Spak/OSR1磷酸化NKCC1氨基末端多個蘇氨酸(Thr203/Thr207/Thr212),從 而 激 活NKCC1[31]。根據(jù)Gagnon和Delpire[32]在2010年的研究報告,蛋白磷酸酶參與NKCC1蛋白的去磷酸化,并進一步證實NKCC1的去磷酸化機制。晚近研究表明,與Spak結(jié)合的鈣結(jié)合蛋白39(Cab39)能夠激活NKCC1,注射編碼Cab39的cDNA可使Spak分子形成二聚體,從而激活NKCC1[33]。其他通過磷酸化調(diào)節(jié)NKCC1活性的因素包括環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、鈣離子等第二信使[19],但在不同物種、組織中其影響有所不同[5],第二信使通過與細胞內(nèi)信號級聯(lián)的組織特異性中間體相互作用,而并非與離子本身相互作用而影響NKCC1的活性表達。

        三、NKCC1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

        研究表明,在組織器官損傷過程中均有NKCC1的異常表達,且參與多種疾病的病理生理學機制,例 如急性肺 損傷[16]、肝 性腦?。?7]、鉛中毒[23]等,尤其是腦卒中、癲 、膠質(zhì)細胞瘤或精神分裂癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與其關(guān)系密切相關(guān)。

        1.NKCC1與腦卒中 離子穩(wěn)態(tài)失衡是腦缺血誘導(dǎo)細胞損傷的重要機制,而陽離子?氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白不僅在神經(jīng)元氯離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,而且對維持血?腦屏障通透性、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞內(nèi)正常離子濃度,以及細胞容積同樣至關(guān)重要[34]。缺血性腦損傷發(fā)生后,細胞外鉀離子濃度升高,大量谷氨酸自細胞內(nèi)釋放,胞內(nèi)鈣、鈉、氯離子濃度超負荷;此時,雖然腦組織缺血?缺氧引起的能量代謝障礙可使Na+?K+?ATP酶分泌受抑制,但NKCC1仍可通過表達增加和活性增強進一步介導(dǎo)鈉離子內(nèi)流,使細胞內(nèi)滲透壓增高,由于細胞外水分向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細胞水腫[35],而且血?腦屏障上的NKCC1過表達使腦組織進一步攝取水分,腦水腫加劇,患者可因顱內(nèi)高壓而誘發(fā)腦疝并危及生命。付學軍等[36]通過對大腦中動脈閉塞大鼠模型的觀察發(fā)現(xiàn),缺血?缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞的死亡方式主要以破碎為主,所見腫脹、核溶解等表現(xiàn)與脹亡的形態(tài)學變化相吻合,提示NKCC1導(dǎo)致的細胞水腫與缺血?缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞脹亡密切相關(guān),而神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞腫脹可導(dǎo)致細胞間緊密連接破壞,進而破壞血?腦屏障,加重腦水腫[37]。此外,NKCC1導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈉離子聚積可迅速激活Na+/Ca2+交換蛋白的反向轉(zhuǎn)運,使鈣離子大量進入細胞內(nèi),細胞內(nèi)鈣離子超載,繼而引起細胞損傷[38]。此外,腦卒中后的炎癥反應(yīng)也可促進NKCC1的表達[27],加劇細胞損傷。晚近研究表明,新型NKCC1抑制劑STS666對縮小腦梗死體積、保護神經(jīng)元具有明顯療效[22],因此NKCC1可能成為治療急性缺血性卒中的重要靶點。Zeniya等[39]認為,血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有促進Spak和NKCC1磷酸化的作用,這可能是NKCC1在缺血性卒中合并高血壓患者腦組織中呈高表達的原因之一,因此對于缺血性卒中合并高血壓的患者,以NKCC1為靶點可能療效更佳。有研究顯示,NKCC1亦可作為缺血性卒中后抑郁的治療靶點,呈高表達的白細胞介素?18(IL?18)可通過IL?18受體/NKCC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起卒中后抑郁,若以IL?18及其下游的NKCC1作為靶點,可能是預(yù)防和治療缺血性卒中后抑郁頗具前景的策略[40],但相關(guān)機制尚待深入研究。

        3.NKCC1與膠質(zhì)細胞瘤 膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見亦是最具侵襲性的原發(fā)性腫瘤,其對腦組織具有極強的侵襲性和浸潤性。研究證實,在膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移過程中,為了便于在腦組織中“穿行”可通過離子轉(zhuǎn)運而不斷調(diào)節(jié)其體積大小,NKCC1則可通過氯離子轉(zhuǎn)運快速調(diào)節(jié)腫瘤細胞的這種體積變化[28]。NKCC1在膠質(zhì)母細胞瘤中呈高表達,NKCC1抑制劑可降低腫瘤細胞的擴散能力[8]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可使上皮細胞的細胞極性和細胞黏附功能消失,使上皮細胞獲得遷移能力,提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[46]。晚近研究發(fā)現(xiàn),ras相關(guān)蛋白Rac1和轉(zhuǎn)化蛋白RhoA通路在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,NKCC1通過Rac1和RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[47],從而促進腫瘤細胞的遷移??鼓[瘤藥物實驗發(fā)現(xiàn),替莫唑胺可降低腫瘤細胞中鉀離子和氯離子濃度,使腫瘤細胞體積縮小并誘導(dǎo)其凋亡,同時可激活WNK?NKCC1通路;NKCC1特異性抑制劑布美他尼可使細胞內(nèi)鉀離子和氯離子丟失加劇,促進腫瘤細胞凋亡[48]??傊?,NKCC1可通過調(diào)節(jié)細胞體積,以及Rac1和RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與膠質(zhì)母細胞瘤的侵襲過程,抑制NKCC1表達,促進腫瘤細胞凋亡[49?50],因此針對膠質(zhì)母細胞瘤侵襲能力的治療,以NKCC1作為靶點具有可行性。

        4.NKCC1與精神分裂癥 精神分裂癥是一類重型精神病,其發(fā)病機制尚不十分清楚,通常認為與神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂有關(guān),尤其是前額葉皮質(zhì)GABA代謝異??赡芘c精神分裂癥的神經(jīng)功能障礙有關(guān)[51]。有研究顯示,精神分裂癥患者海馬KCC2 mRNA表達下調(diào)、NKCC1/KCC2比值增加,從而影響GABA的分泌與代謝,引起神經(jīng)功能障礙[52]。Spak是NKCC1發(fā)生磷酸化并被激活的“催化劑”,Spak基因敲除增強了精神分裂癥模型小鼠的探索能力,而且大腦KCC2表達水平顯著升高,提示改變NKCC1/KCC2比值可能改善小鼠精神分裂癥相關(guān)癥狀[53]。研究發(fā)現(xiàn),精神分裂癥患者腦組織中的NKCC1隨著WNK3和OSR1 mRNA表達的上調(diào)而升高,使GABA介導(dǎo)的細胞電位改變,參與精神分裂癥的發(fā)生與發(fā)展[54]。推測NKCC1和KCC2可能是調(diào)節(jié)GABA能信號的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但是否參與神經(jīng)分裂癥的發(fā)病,有待進一步深入研究。

        綜上所述,作為重要的離子轉(zhuǎn)運體,NKCC1表達變化受DNA甲基化和蛋白質(zhì)磷酸化等多種因素的調(diào)節(jié),通過對NKCC1的研究增進了對氯離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的理解。NKCC1通過調(diào)節(jié)GABA能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞體積參與多種生理活動和神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程,因此以NKCC1為治療靶點具有重要研究意義及應(yīng)用價值。

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