付旭陽 孫健淇 呂軍 石瑞麗

鈉?鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1（NKCC1）作為人體內(nèi)的重要離子轉(zhuǎn)運體，主要介導(dǎo)鈉、鉀、氯等離子由細胞外向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，對氯離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控發(fā)揮重要作用。NKCC1存在多個磷酸化位點和啟動子甲基化位點，與其表達與活性調(diào)控密切相關(guān)，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中均能觀察到NKCC1的異常變化［1］。布美他尼作為NKCC1特異性抑制劑，可用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，如低劑量布美他尼用于治療小兒孤獨癥，可改善社交、互動和興趣受限行為［2］；針對動物缺血?再灌注腦損傷模型的研究顯示，布美他尼還可通過抑制NKCC1活性而發(fā)揮腦保護作用［3］?；诖?，本文擬綜述NKCC1的最新研究進展并分析將NKCC1作為治療靶點治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能性，為疾病防治提供新的研究思路。

一、NKCC1的結(jié)構(gòu)與功能

1.NKCC1結(jié)構(gòu) 鈉?鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（NKCCs）屬于Slc12a家族，該家族包含數(shù)個基因，如編碼NKCC2的Slc12a1基因、編碼NKCC1的Slc12a2基因、編碼鈉?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（NCC）的Slc12a3基因、編碼鉀?氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（KCC）1~4的Slc12a4?7基因等［4］。人類NKCC1共包含1212個氨基酸殘基，轉(zhuǎn)錄本為7.4 kb，相對分子質(zhì)量131.4×103，其編碼基因位于第5號染色體［5］。NKCC1擁有較大的氨基端（N端）和羧基端（C端），N端大部分無序，包含調(diào)控區(qū)域，其中的氨基酸磷酸化狀態(tài)決定了NKCC1的生物活性，不同物種的NKCC1蛋白N端具有序列多樣性［6］。人類細胞試驗顯示，NKCC1蛋白的N端具有糖基化修飾，約25%的NKCC1蛋白N端為復(fù)雜型N?糖基化，其余75%的NKCC1蛋白N端為高甘露糖糖基化和混合糖基化［7］。NKCC1蛋白經(jīng)翻譯修飾后，約10%到達質(zhì)膜，且大部分為高甘露糖型，其余90%的NKCC1蛋白分布在細胞內(nèi)，其N端糖基化在NKCC1的協(xié)同轉(zhuǎn)運功能中發(fā)揮重要作用，但尚無證據(jù)表明糖基化與蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位有關(guān)［7］。NKCC1蛋白C端高度保守且與陽離子?氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白家族呈高度同源，其作用目前尚不明確，期待未來進行深入研究探討。

2.NKCC1功能 NKCC1表達廣泛，除外分泌上皮細胞，其在心臟、骨骼肌神經(jīng)元等非分泌上皮細胞中也有分布。既往研究證明，NKCC1表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的全腦神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、脈絡(luò)叢上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元［4］；而近期有研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中、膠質(zhì)細胞瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病亦可導(dǎo)致NKCC1表達異常［1，8］，同時NKCC1還參與不同組織細胞的離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞體積和質(zhì)量調(diào)節(jié)，以及神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等正常生理功能［9］。正常情況下，Na+?K+?ATP酶提供能量并將鈉離子和鉀離子轉(zhuǎn)運至細胞外，而NKCC1以繼發(fā)主動轉(zhuǎn)運的方式消耗能量進行離子跨膜轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)鈉、鉀、氯離子向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)［9］。研究顯示，NKCC1通過離子轉(zhuǎn)運方式改變細胞滲透壓，調(diào)節(jié)細胞體積，在高滲環(huán)境下，細胞失水皺縮需觸發(fā)適當?shù)恼{(diào)節(jié)機制以增大細胞體積，此時NKCC1被激活，介導(dǎo)離子向細胞內(nèi)泵入，完成細胞體積的調(diào)節(jié)；當細胞處于低滲狀態(tài)時，細胞吸水膨脹，NKCC1呈低活性狀態(tài)，相反，KCC2被激活，介導(dǎo)鉀離子和氯離子外流，滲透壓降低，水分子隨之流出細胞，恢復(fù)細胞體積［10］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1（mTOR1）受上游的生長因子和必需氨基酸調(diào)控，調(diào)節(jié)細胞生長［11］，近期研究發(fā)現(xiàn)［12］NKCC1對L型氨基酸轉(zhuǎn)運載體1（LAT1）和細胞表面抗原4F2重鏈（4F2hc）所形成的LAT1?4F2hc復(fù)合體發(fā)揮負調(diào)控作用，其在調(diào)控LAT1的同時降低mTOR1活性，通過此途徑參與細胞的生長調(diào)節(jié)。γ?氨基丁酸（GABA）是重要的抑制性中樞神經(jīng)遞質(zhì)，其受體為離子門控通道，當該通道被激活時，氯離子可由此流出或流入細胞。在正常生理狀態(tài)下，成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)KCC2呈高表達、NKCC1呈低表達［4］，當氯離子細胞內(nèi)濃度低于細胞外時，GABA受體被激活，氯離子內(nèi)流，細胞超極化；而在病理狀態(tài)下，NKCC1表達升高，氯離子轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，細胞內(nèi)氯離子濃度升高，此時若GABA受體被激活，反使氯離子內(nèi)流減少、胞膜超極化水平降低，甚至發(fā)生氯離子外流、細胞去極化［13］。上述研究提示，NKCC1可通過調(diào)控細胞內(nèi)氯離子濃度，改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA的生物學效應(yīng)。不同神經(jīng)元中NKCC1的作用有所不同，例如在視交叉上核中，大部分神經(jīng)元可產(chǎn)生GABA作為神經(jīng)元之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，GABA亦可使大部分神經(jīng)元產(chǎn)生抑制性電位［14］，但有研究顯示，視交叉上核背側(cè)和腹側(cè)的GABA可以產(chǎn)生興奮性電位，并且這種興奮性作用可被NKCC1抑制劑布美他尼所阻斷［15］。總結(jié)上述兩項研究可以發(fā)現(xiàn)，GABA興奮和抑制電位的產(chǎn)生系由NKCC1功能狀態(tài)所決定的，NKCC1活躍時，氯離子濃度升高、產(chǎn)生興奮性電位，反之，則產(chǎn)生抑制性電位，提示這兩種不同的電位與NKCC1所介導(dǎo)的不同的細胞內(nèi)氯離子濃度變化有關(guān)。晚近研究顯示，NKCC1表達受視交叉上核內(nèi)環(huán)境光照調(diào)控［16］，NKCC1 mRNA在視網(wǎng)膜色素上皮細胞亦存在節(jié)律性表達，NKCC1表達量的改變可導(dǎo)致GABA產(chǎn)生不同的生物學效應(yīng)，進而參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律［17］。

二、NKCC1表達與活性的調(diào)控

NKCC1在人類胎兒期呈高表達，KCC2呈低表達，隨著年齡的增長，NKCC1表達逐漸降低，KCC2表達逐漸升高，使GABA介導(dǎo)的神經(jīng)元離子電化學反應(yīng)由超極化向去極化轉(zhuǎn)變［18］。研究顯示，在胎兒成長過程中其體內(nèi)的NKCC1活性隨著母體循環(huán)中催產(chǎn)素水平的增加而逐漸降低，使GABA能信號產(chǎn)生抑制性電位，后者在分娩過程中產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護作用可幫助胎兒適應(yīng)分娩時的不良刺激，此為胎兒抗神經(jīng)損傷的一種生理學機制［19］。而在病理或特定環(huán)境下，NKCC1的表達會因蛋白質(zhì)磷酸化、DNA甲基化或炎性細胞因子刺激等因素的影響而發(fā)生改變［20?22］。

1.NKCC1的表達調(diào)節(jié) 研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白2（STAT2）的可結(jié)合位點位于NKCC1轉(zhuǎn)錄起始點上游的30和500 bp處［23］，但有關(guān)STAT2對NKCC1表達變化的影響至今尚不十分清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學機制之一，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化完成。DNA高甲基化與基因轉(zhuǎn)錄阻遏相關(guān)，DNA低甲基化可促進基因轉(zhuǎn)錄。在正常情況下，大鼠Slc12a啟動子甲基化水平隨其月齡的增加而逐漸升高，隨著DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的增強，可使NKCC1的表達維持在低水平狀態(tài)；而自發(fā)性高血壓模型大鼠體內(nèi)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性則隨其月齡的增加而呈逐漸衰減趨勢，Slc12a基因啟動子呈低甲基化水平，這可能是NKCC1在自發(fā)性高血壓人群中呈高表達的重要病生 理 學 機制［24］。Unal等［25］發(fā)現(xiàn)，與 健 康 對 照組 相比，顳葉癲 患者病灶組織中NKCC1甲基化水平表達異常，提示NKCC1可能通過甲基化改變其表達量，從而參與難治性顳葉癲 的發(fā)病過程。Lee等［1］采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5?azadC處理正常大鼠皮質(zhì)組織切片，發(fā)現(xiàn)5?azad C可顯著提高NKCC1的表達；對大腦中動脈閉塞（MCAO）缺血大鼠模型的觀察亦發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷大鼠皮質(zhì)NKCC1相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均升高，且患側(cè)大腦皮質(zhì)Slc12a外顯子1區(qū)DNA甲基化程度明顯低于健側(cè)，推測與NKCC1 mRNA及其蛋白質(zhì)重新表達有關(guān)。該研究結(jié)果提示，DNA甲基化參與對NKCC1表達的調(diào)控。除此之外，一些炎性因子亦與NKCC1的表達變化存在一定關(guān)聯(lián)性。Weidenfeld和Kuebler［26］發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子?α（TNF?α）等炎性因子可上調(diào)急性肺損傷模型小鼠NKCC1的表達水平，TNF?α缺陷模型小鼠小腦及大腦皮質(zhì)NKCC1表達均降低，注射TNF?α后其NKCC1表達顯著升高［27］，提示TNF?α具有促進NKCC1表達的作用。原代星形膠質(zhì)細胞實驗顯示，TNF?α或白細胞介素?1β（IL?1β）可顯著增加NKCC1相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)的表達，并可隨其體內(nèi)濃度的降低而下調(diào)［28］。但上述研究仍不能明確炎性因子激活NKCC1表達的作用是否具有特異性，其他細胞因子是否也參與炎性損傷時對NKCC1表達的調(diào)節(jié)。

2.NKCC1的活性調(diào)節(jié) 1992年，Lytle和Forbush［29］首次報告NKCC1磷酸化對其功能的影響：NKCC1抑制劑布美他尼注射于經(jīng)高滲溶液皺縮的鯊魚直腸腺細胞內(nèi)即可見細胞內(nèi)鉀離子濃度迅速升高，該作者認為細胞內(nèi)鉀離子濃度的變化與NKCC1蛋白中絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化有關(guān)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，NKCCs家族的生物活性與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（WNK）、STE20/SPS?1相關(guān)性脯氨酸?丙氨酸激酶（Spak）和氧化應(yīng)激反應(yīng)激酶（OSR1）磷酸化有關(guān)。與正常小鼠相比，Spak基因敲除小鼠感覺神經(jīng)元NKCC1活性下降2倍，表明Spak參與了NKCC1的活化過程［30］。WNK3激活NKCC1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路需Spak/OSR1的參與，Spak/OSR1與WNK3在其Thr233和Thr185兩個氨基酸位點結(jié)合，通過已磷酸化的WNK3 T環(huán)激活Spak/OSR1，活化的Spak/OSR1磷酸化NKCC1氨基末端多個蘇氨酸（Thr203/Thr207/Thr212），從 而 激 活NKCC1［31］。根據(jù)Gagnon和Delpire［32］在2010年的研究報告，蛋白磷酸酶參與NKCC1蛋白的去磷酸化，并進一步證實NKCC1的去磷酸化機制。晚近研究表明，與Spak結(jié)合的鈣結(jié)合蛋白39（Cab39）能夠激活NKCC1，注射編碼Cab39的cDNA可使Spak分子形成二聚體，從而激活NKCC1［33］。其他通過磷酸化調(diào)節(jié)NKCC1活性的因素包括環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、鈣離子等第二信使［19］，但在不同物種、組織中其影響有所不同［5］，第二信使通過與細胞內(nèi)信號級聯(lián)的組織特異性中間體相互作用，而并非與離子本身相互作用而影響NKCC1的活性表達。

三、NKCC1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

研究表明，在組織器官損傷過程中均有NKCC1的異常表達，且參與多種疾病的病理生理學機制，例 如急性肺 損傷［16］、肝 性腦?。?7］、鉛中毒［23］等，尤其是腦卒中、癲 、膠質(zhì)細胞瘤或精神分裂癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與其關(guān)系密切相關(guān)。

1.NKCC1與腦卒中 離子穩(wěn)態(tài)失衡是腦缺血誘導(dǎo)細胞損傷的重要機制，而陽離子?氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白不僅在神經(jīng)元氯離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，而且對維持血?腦屏障通透性、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞內(nèi)正常離子濃度，以及細胞容積同樣至關(guān)重要［34］。缺血性腦損傷發(fā)生后，細胞外鉀離子濃度升高，大量谷氨酸自細胞內(nèi)釋放，胞內(nèi)鈣、鈉、氯離子濃度超負荷；此時，雖然腦組織缺血?缺氧引起的能量代謝障礙可使Na+?K+?ATP酶分泌受抑制，但NKCC1仍可通過表達增加和活性增強進一步介導(dǎo)鈉離子內(nèi)流，使細胞內(nèi)滲透壓增高，由于細胞外水分向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細胞水腫［35］，而且血?腦屏障上的NKCC1過表達使腦組織進一步攝取水分，腦水腫加劇，患者可因顱內(nèi)高壓而誘發(fā)腦疝并危及生命。付學軍等［36］通過對大腦中動脈閉塞大鼠模型的觀察發(fā)現(xiàn)，缺血?缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞的死亡方式主要以破碎為主，所見腫脹、核溶解等表現(xiàn)與脹亡的形態(tài)學變化相吻合，提示NKCC1導(dǎo)致的細胞水腫與缺血?缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞脹亡密切相關(guān)，而神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞腫脹可導(dǎo)致細胞間緊密連接破壞，進而破壞血?腦屏障，加重腦水腫［37］。此外，NKCC1導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈉離子聚積可迅速激活Na+/Ca2+交換蛋白的反向轉(zhuǎn)運，使鈣離子大量進入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)鈣離子超載，繼而引起細胞損傷［38］。此外，腦卒中后的炎癥反應(yīng)也可促進NKCC1的表達［27］，加劇細胞損傷。晚近研究表明，新型NKCC1抑制劑STS666對縮小腦梗死體積、保護神經(jīng)元具有明顯療效［22］，因此NKCC1可能成為治療急性缺血性卒中的重要靶點。Zeniya等［39］認為，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）具有促進Spak和NKCC1磷酸化的作用，這可能是NKCC1在缺血性卒中合并高血壓患者腦組織中呈高表達的原因之一，因此對于缺血性卒中合并高血壓的患者，以NKCC1為靶點可能療效更佳。有研究顯示，NKCC1亦可作為缺血性卒中后抑郁的治療靶點，呈高表達的白細胞介素?18（IL?18）可通過IL?18受體/NKCC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起卒中后抑郁，若以IL?18及其下游的NKCC1作為靶點，可能是預(yù)防和治療缺血性卒中后抑郁頗具前景的策略［40］，但相關(guān)機制尚待深入研究。

3.NKCC1與膠質(zhì)細胞瘤 膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見亦是最具侵襲性的原發(fā)性腫瘤，其對腦組織具有極強的侵襲性和浸潤性。研究證實，在膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移過程中，為了便于在腦組織中“穿行”可通過離子轉(zhuǎn)運而不斷調(diào)節(jié)其體積大小，NKCC1則可通過氯離子轉(zhuǎn)運快速調(diào)節(jié)腫瘤細胞的這種體積變化［28］。NKCC1在膠質(zhì)母細胞瘤中呈高表達，NKCC1抑制劑可降低腫瘤細胞的擴散能力［8］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可使上皮細胞的細胞極性和細胞黏附功能消失，使上皮細胞獲得遷移能力，提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［46］。晚近研究發(fā)現(xiàn)，ras相關(guān)蛋白Rac1和轉(zhuǎn)化蛋白RhoA通路在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，NKCC1通過Rac1和RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［47］，從而促進腫瘤細胞的遷移?？鼓[瘤藥物實驗發(fā)現(xiàn)，替莫唑胺可降低腫瘤細胞中鉀離子和氯離子濃度，使腫瘤細胞體積縮小并誘導(dǎo)其凋亡，同時可激活WNK?NKCC1通路；NKCC1特異性抑制劑布美他尼可使細胞內(nèi)鉀離子和氯離子丟失加劇，促進腫瘤細胞凋亡［48］?？傊?，NKCC1可通過調(diào)節(jié)細胞體積，以及Rac1和RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與膠質(zhì)母細胞瘤的侵襲過程，抑制NKCC1表達，促進腫瘤細胞凋亡［49?50］，因此針對膠質(zhì)母細胞瘤侵襲能力的治療，以NKCC1作為靶點具有可行性。

4.NKCC1與精神分裂癥 精神分裂癥是一類重型精神病，其發(fā)病機制尚不十分清楚，通常認為與神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，尤其是前額葉皮質(zhì)GABA代謝異?？赡芘c精神分裂癥的神經(jīng)功能障礙有關(guān)［51］。有研究顯示，精神分裂癥患者海馬KCC2 mRNA表達下調(diào)、NKCC1/KCC2比值增加，從而影響GABA的分泌與代謝，引起神經(jīng)功能障礙［52］。Spak是NKCC1發(fā)生磷酸化并被激活的“催化劑”，Spak基因敲除增強了精神分裂癥模型小鼠的探索能力，而且大腦KCC2表達水平顯著升高，提示改變NKCC1/KCC2比值可能改善小鼠精神分裂癥相關(guān)癥狀［53］。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者腦組織中的NKCC1隨著WNK3和OSR1 mRNA表達的上調(diào)而升高，使GABA介導(dǎo)的細胞電位改變，參與精神分裂癥的發(fā)生與發(fā)展［54］。推測NKCC1和KCC2可能是調(diào)節(jié)GABA能信號的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是否參與神經(jīng)分裂癥的發(fā)病，有待進一步深入研究。

綜上所述，作為重要的離子轉(zhuǎn)運體，NKCC1表達變化受DNA甲基化和蛋白質(zhì)磷酸化等多種因素的調(diào)節(jié)，通過對NKCC1的研究增進了對氯離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的理解。NKCC1通過調(diào)節(jié)GABA能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞體積參與多種生理活動和神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程，因此以NKCC1為治療靶點具有重要研究意義及應(yīng)用價值。

利益沖突 無