陽梅 廖詩平 鄭焱江 植茂輝 何張裕

(1.四川大學華西醫(yī)院血液內科，四川 成都 610041；2.四川大學華西護理學院，四川 成都 610041；3.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川 成都 610041 )

不同原因造成的皮膚損傷是外科領域常見的臨床挑戰(zhàn)，如何加快創(chuàng)面組織愈合，獲得理想的療效一直是臨床工作追求的目標。研究表明72.5%的慢性創(chuàng)面由感染導致，是阻礙創(chuàng)面正常修復的重要因素之一[1-3]。完全上皮化是創(chuàng)面臨床愈合的標志，而感染性創(chuàng)面由于處于病理性炎癥狀態(tài)，炎性細胞在局部過度積累，且炎性介質調節(jié)機制失調，加重組織損傷程度，導致創(chuàng)面上皮化進程緩慢[4-7]。在創(chuàng)面治療方面，西醫(yī)主要以外用抗生素或激素治療為主，但近年來細菌的耐藥情況日趨嚴重，并且病人對藥物敏感，導致療效不佳。中醫(yī)學對于創(chuàng)傷的修復具有豐富的經(jīng)驗和獨特的治療方案，在長期的歷史發(fā)展中形成了獨具特色的理論體系。中醫(yī)普遍認為創(chuàng)面的形成是由于全身營養(yǎng)消耗明顯，氣血虧虛，不能營養(yǎng)肌膚，摩擦破傷感染，引起壞死潰爛[8-10]。因此，中醫(yī)創(chuàng)立了祛瘀生肌、偎膿長肉等重要理論與治法。在中醫(yī)臨床實踐中，藥物療效和安全性往往相悖，如朱紅膏治療慢性皮膚潰瘍，但因含汞元素，臨床安全期僅有6周。因此需要開發(fā)新的安全有效的中藥制劑治療感染性創(chuàng)面[11]。生皮散是改良的新型中成藥制劑，以兒茶、冰片、沒藥、乳香、三七等十味中藥配伍組成，配方中兒茶、沒藥、乳香、三七、血竭等均能祛腐生肌、活血；而冰片、枯礬、黃柏、滑石等能清熱解毒。有研究報道，生皮散對大鼠壓瘡具有較好的治療效果，可以顯著抑制壓瘡局部的炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，縮短創(chuàng)面愈合時間[12]。為探討生皮散對感染性創(chuàng)面的治療效果和可能的作用機制，本研究通過構建大鼠感染性創(chuàng)面模型，觀察外敷生皮散后大鼠感染性創(chuàng)面的愈合情況，同時采用激光多普勒血流儀檢測創(chuàng)面微循環(huán)的變化情況，探討生皮散修復創(chuàng)面的作用機制，為其臨床用藥提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥品 生皮散，組成：兒茶12 g、煅牡蠣25 g、冰片1.2 g、沒藥7.5 g、乳香7.5 g、枯礬6 g、三七6 g、黃柏7 g、血竭 50 g、滑石 15 g。制作方法：以上各藥共研細末，過100目篩，待用。以上中藥飲片均購置于四川省中藥飲片有限責任公司,批號：150523。用法用量：外敷，一次4 g生皮散原生藥材，一日2次；即臨床成人(均以60 kg體重計)日用劑量擬定為0.13 g(原生藥材)/kg/d。用時溶于蒸餾水成膏狀備用。七厘散：散劑，規(guī)格：3 g/瓶。用法用量：口服，一次1～1.5g，一日1～3次；外用，調敷患處。北京同仁堂出品，批號：20150716，實驗時用滅菌水制成膏狀備用。

1.2 試劑與儀器 水合氯醛：分析純，AR級，成都市科龍化工試劑廠，批號：20150619。實驗時用純凈水配制成濃度10%。激光多普勒血流儀(PeriFlux 5000系統(tǒng))，瑞典帕瑞醫(yī)學。AX-70顯微鏡成像系統(tǒng)，OLYMPUS。

1.3 實驗動物 SD大鼠，健康一級，體重(250±20)g，雌雄各半，四川大學試驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2009-09，清潔級。于恒溫清潔環(huán)境中進行適應性飼養(yǎng)，飲水進食不限，持續(xù)1周。

1.4 菌株 金黃色葡萄球菌，由四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院微生物教研室提供。

1.5 方法

1.5.1 感染性創(chuàng)面模型制備 參照楊嘉駿等[13]制備大鼠感染性創(chuàng)面模型的方法。用剃毛器將大鼠背部區(qū)域毛發(fā)剃除，面積3 cm×3 cm。1 d后將以10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射對大鼠進行麻醉，并在脫毛區(qū)域用1.5 cm×1.5 cm的塑料框架蘸苦味酸標記造模面積，在無菌條件下切除標記處全層皮膚，深至筋膜，充分止血后在創(chuàng)面噴灑金黃色葡萄球菌的PBS液0.2 mL(1×109CFU/mL)。創(chuàng)面覆蓋透明薄膜敷貼并用無菌醫(yī)用紗布包裹固定，待清醒后單籠飼養(yǎng)。48 h后創(chuàng)面出現(xiàn)不同程度感染征象，如創(chuàng)面附有膿性分泌物，創(chuàng)緣皮色發(fā)紅，表示造模成功。

1.5.2 實驗分組及給藥 將符合條件的60只SD大鼠，隨機選取10只作為空白組(正常大鼠)，其余大鼠制備感染性創(chuàng)面模型。48 h后，將接種細菌的大鼠隨機分為模型組、陽性對照藥七厘散組(0.45 g/kg)、生皮散高、中、低劑量組(1.8 g/kg、0.9 g/kg、0.45 g/kg)。給藥組和陽性對照組按分組給藥，連續(xù)15 d?？瞻捉M用蒸餾水沖洗后不作處理。

1.5.3 觀察指標

1.5.3.1 創(chuàng)面愈合情況 分別在造模后第3、5、7、10、15 d用透明硫酸銅板紙貼在創(chuàng)面表面，用筆在紙上描記創(chuàng)面面積。

1.5.3.2 形態(tài)學檢測 給藥后15 d取各組大鼠創(chuàng)面與正常皮膚交界組織，進行固定、石蠟包埋、切面，常規(guī)HE染色。根據(jù)盲法原則，采用OLYMPUS公司AX-70顯微鏡成像系統(tǒng)進行觀察分析及照相。

1.5.3.3 創(chuàng)面微循環(huán)血流量的測定 使用激光多普勒血流儀分別測量大鼠創(chuàng)面微循環(huán)血流量，血流量指標包括：血流灌注量(PU)、血細胞聚集程度(CMBC)以及運動血細胞速率(Velocity)。大鼠麻醉后，在室溫(25℃)下適應環(huán)境30 min。激光多普勒血流儀預熱30 min，并校準。選用公司配置的接觸型探頭，分別于給藥前和給藥后15 d測量創(chuàng)面微循環(huán)的相關指標。并計算出血流量的變化率。變化率=(造模前血流量-給藥15 d后血流量)/給藥前血流量×100%；血流灌注量變化率(PU)=(造模前PU-給藥15d后PU)/造模前CMBC；血細胞聚集程度(CMBC)=(造模前CMBC-給藥15d后CMBC)/造模前CMBC；運動血細胞的速率(Velocity)=(造模前Velocity-給藥15d后Velocity)/造模前Velocity。

2 結果

2.1 生皮散對大鼠體表感染創(chuàng)面愈合的作用 在大鼠創(chuàng)面滴加金黃葡萄球菌48 h后，出現(xiàn)不同程度感染，創(chuàng)面附有膿性分泌物，滲液較多，創(chuàng)緣皮色發(fā)紅。每日新鮮配置不同濃度的生皮散等量涂于創(chuàng)面，于第3、5、7、10、15 d測量創(chuàng)面面積。與模型組相比，生皮散高劑量組大鼠的創(chuàng)面面積從第5d開始顯著減少(P<0.05)，一直持續(xù)到第15 d；七厘散組和生皮散中、低劑量組大鼠的創(chuàng)面面積從7 d開始顯著減少(P<0.05)，其中，中劑量組持續(xù)至15 d；低劑量組持續(xù)到第10 d。與七厘散組相比，生皮散高、中劑量組大鼠的創(chuàng)面面積無顯著性差別。說明生皮散有明顯促進感染性創(chuàng)面愈合的作用，其中，高、中劑量更好,見圖1、表1。

圖1 治療前后大鼠感染性創(chuàng)面改變Figure 1 Change of infectious wound before and after treatment注：①,②.模型組；③,④.七厘散組；⑤,⑥.生皮散低劑量組；⑦,⑧.生皮散中劑量組：⑨,⑩.生皮散高劑量組

表1 生皮散對大鼠感染性創(chuàng)面大鼠創(chuàng)面面積的影響Table 1 Effect of SPP on area of infectious wound in rat

2.2 生皮散對大鼠感染性創(chuàng)面的病理學改變 空白組上皮組織大部分生成，表皮細胞分化良好，接近正常上皮，其下為平行排列的膠原纖維及小血管；模型組新生表皮較空白組表皮肥厚，其下可見大量增生的膠原纖維及炎性細胞，部分出現(xiàn)壞死后鈣化；生皮散組鏡下顯示，中、低劑量組新生表皮均較空白組表皮肥厚，其下為增生的膠原纖維及少量炎細胞，高劑量組新生表皮和空白組接近，僅部分出現(xiàn)炎癥細胞，見圖2。

圖2 生皮散對大鼠感染性創(chuàng)面的病理學改變(200×)Figure 2 Pathological changes of SPP on infectious wound in rats 注：A.假手術組；B.模型組；C.七厘散組；D.生皮散低劑量組；E.生皮散中劑量組；F.生皮散高劑量組

2.3 生皮散對大鼠感染性創(chuàng)面微循環(huán)的保護作用 與空白組相比，模型組PU、CMBC以及Velocity變化率均明顯增高(P<0.01)，說明造模后，大鼠的創(chuàng)面組織微循環(huán)發(fā)生嚴重障礙。與模型組相比，七厘散組和生皮散低劑量組的CMBC和Velocity變化率，生皮散中劑量組的PU和CMBC變化率以及生皮散高劑量組的PU、CMBC、Velocity變化率均顯著降低(P<0.05)。與七厘散組相比，生皮散中劑量的PU，高劑量的PU和Velocity均顯著降低(P<0.05)。說明生皮散能改善大鼠感染創(chuàng)面的微循環(huán)，生皮散高劑量組效果更好,見表2、圖3。

表2 生皮散對大鼠感染性創(chuàng)面微循環(huán)變化率的影響Table 2 Effect of SPP on change rate of infectious wound microcirculation in rat

圖3 生皮散對大鼠感染性創(chuàng)面微循環(huán)變化率的影響Figure 3 Effect of SPP on change rate of infectious wound microcirculation in rat

3 討論

感染性創(chuàng)面是臨床多種疾病常見的并發(fā)癥，如下肢靜脈潰瘍和糖尿病足部潰瘍，壞疽性膿皮病以及外傷或放射性損傷合并感染等導致的創(chuàng)面等[14]。不同原因導致的感染性創(chuàng)面有不同的病理生理過程，但共同的結局是創(chuàng)面愈合緩慢或愈合后復發(fā)，顯著降低了患者的生活質量，是臨床治療的難點[15-16]。

現(xiàn)代病理學認為創(chuàng)傷愈合是再生肉芽組織的充填及上皮組織覆蓋而愈的過程[17]。研究發(fā)現(xiàn)生肌類中藥具有促進瘡瘍愈合的作用，該類中藥除了加強創(chuàng)面免疫細胞活性、促進細胞生長因子之外，還能夠顯著改善創(chuàng)面微循環(huán)，因此在創(chuàng)面愈合中療效顯著[18]。

微循環(huán)是血液循環(huán)中非常重要的組成部分，包括微動脈、毛細血管、微靜脈。血液微循環(huán)和淋巴微循環(huán)一起組成微循環(huán)功能單元，承擔血液與組織之間氧、營養(yǎng)必需物質和代謝產(chǎn)物的交換及能量、信息傳輸，承擔血流流通、分配、組織灌注和一系列反饋調節(jié)、內環(huán)境穩(wěn)定機制[19-20]。因此，微循環(huán)不僅是整體循環(huán)系統(tǒng)的末梢部分，也是許多器官中獨立的功能單位，在保持人體正常生理功能，各種疾病發(fā)生、發(fā)展和藥物作用機制中占突出地位[21]。由于各種原因導致行動不便的病人，因長期久臥致使皮膚表面無法及時更新血流供給，加之醫(yī)院易形成交叉感染，導致感染創(chuàng)面形成。有研究證實隨著創(chuàng)傷形成時間的延長，創(chuàng)面細小血管內血流速度逐漸減慢，甚至會發(fā)生瘀滯栓塞[22]。創(chuàng)面微循環(huán)障礙，不但導致局部營養(yǎng)物質供應減少和代謝產(chǎn)物積聚，還會造成創(chuàng)面免疫細胞數(shù)量減少、功能下降，抗感染能力減弱[23]。所以，改善微循環(huán)對于創(chuàng)面治療是非常重要的環(huán)節(jié)。

生皮散的組成成分兒茶、沒藥、乳香、三七、血竭等均能祛腐生肌和活血，因此生皮散具有改善血液循環(huán)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)生皮散的外敷使得創(chuàng)面局部的血液循環(huán)得以改善，創(chuàng)面血管擴張，新生毛細血管的數(shù)量增加，血流量增加，免疫細胞增加，促進淤血合增生的軟化組織被吸收，也為創(chuàng)傷組織提供愈合所需的條件和營養(yǎng)。生皮散中藥制劑其組分可以有效改善創(chuàng)面局部微循環(huán)狀況，調動皮膚修復功能，促進創(chuàng)面愈合。然而由于該中藥方劑中藥味成分較多，還需要深入研究探索各組分的作用特點，闡明復方制劑的作用機制，為臨床用藥奠定實驗基礎。

4 結論

本實驗采用切除全層皮膚，并在創(chuàng)面滴加金黃葡萄球菌的方法制備大鼠感染性創(chuàng)傷模型，造模48h后創(chuàng)面出現(xiàn)不同程度感染特征：創(chuàng)面附有膿性分泌物，滲液較多，創(chuàng)面邊緣皮色發(fā)紅。給予生皮散15d后，創(chuàng)傷面積顯著縮小，炎癥細胞減少，出現(xiàn)大量新生肉芽組織；創(chuàng)面組織微循環(huán)灌注量、血細胞的聚集程度以及運動學細胞的速率得到明顯改善。表明生皮散對感染性創(chuàng)面有良好的治療作用，具有開發(fā)應用價值。