劉亨晶，李初誼，王 盼，李 斌,2，王俊科，鄭 英，盧利霞，張久聰，于曉輝，甄英麗

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學;3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院第一駐派門診部

急性肝衰竭(actue liver failure，ALF)是一種由病毒、感染、酒精、藥物等引起的致死性疾病，表現(xiàn)為肝細胞的大量壞死和肝功能的急劇下降[1-2]。ALF進展迅速，治療困難，預后差，臨床死亡率高[3]，其主要原因之一就是ALF的發(fā)病機制異常復雜。最新研究報道[4-5]，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路中的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase1/2，ERK1/2)活化可促進ALF的發(fā)生發(fā)展，因此，研究如何抑制ERK1/2通路的活化是治療ALF的關鍵。越來越多的證據(jù)表明，異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)可以通過抑制機體氧化應激反應、清除氧自由基等作用保護肝細胞免受組織損傷，改善肝功能，減輕肝臟的炎癥反應[6-7]，但MgIG是否通過下調(diào)ERK1/2信號通路實現(xiàn)其抗炎保肝的作用目前文獻報道較少，因此，本研究對其機制進行深入探討。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及材料CCl4溶液(AR級)購自汕頭西隴化工廠(批號：20170308)，MgIG注射液購自江蘇正大天晴公司(批號：H20140092)，反轉錄試劑盒(RR047A)、qRT-PCR擴增試劑盒(RR820A)、ERK1/2引物和β-actin引物均購自日本Takara公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司，ERK1/2(4695s)和磷酸化ERK1/2單克隆抗體(9101s)均購自美國Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔IgG(H+L)二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，蛋白分子量Marker購自美國BBI Life Sciences公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和ECL化學發(fā)光液購自北京索萊寶公司，GAPDH抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，SPF級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量為(200±20)g，購自中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科，動物使用許可證號：SYXK(甘)2012-0029。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立ALF大鼠模型：Wistar大鼠于造模前12 h禁食，正常飲水。按4 ml/kg給予CCl4溶液灌胃誘導建立ALF模型。根據(jù)《肝衰竭診治指南(2018年版)》[8]中ALF病理診斷標準來判斷ALF模型是否建立成功。

1.2.2 實驗動物分組：共60只Wistar大鼠，隨機分為5組，其中12只為正常對照組(給予清潔飲用水)，其余48只為實驗組，均建成ALF模型，分為模型組(0.9%的生理鹽液)和MgIG治療組(25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg)。

1.2.3 給藥方式及時間：MgIG治療組腹腔注射3種濃度(25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg)[9-10]的MgIG注射液，模型組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，正常對照組給予等量的清潔飲用水即可，48 h后各組大鼠均腹腔注射3 ml/kg水合氯醛溶液麻醉處死。

1.2.4 取材：充分打開腹腔，取出肝臟，洗凈，觀察大體形態(tài)變化，切取一塊放入4%甲醛固定液，石蠟包埋，另一塊迅速切碎裝入凍存管凍存，用于qRT-PCR和Western blotting測定。

1.2.5 肝臟組織病理學變化：石蠟包埋的肝組織，切片，HE染色，在普通光學顯微鏡鏡下觀察肝衰竭的肝組織。

1.2.6 Western blotting檢測ERK1/2及pERK1/2的表達：取-80 ℃保存的肝組織標本，提取總蛋白，加入5×蛋白上樣緩沖液，進行BCA蛋白濃度測定。按Western blotting相應步驟進行蛋白檢測，配膠、SDS-PAGE電泳、轉膜，再用質量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封閉2 h，然后將PVDF膜裁開，分別加入ERK1/2(1∶1 000)、pERK1/2(1∶2 000)單克隆抗體及GAPDH抗體(1∶2 000)，搖床震蕩30 min，孵育過夜，取出后震蕩洗滌4次，8 min/次，加入二抗工作液(1∶5 000)，余步驟同前。最后將ECL化學發(fā)光顯色液(A∶B=1∶1)滴在PVDF膜，利用曝光儀成像系統(tǒng)進行曝光。

1.2.7 qRT-PCR檢測ERK1/2 mRNA含量：取-80 ℃保存的肝組織標本，液氮碾磨勻漿后按Trizol提取試劑盒說明書快速抽提總RNA，紫外分光光度計測吸光度(A)，計算吸光度比值(A260/A280)為1.8～2.0實時熒光定量，逆轉錄試劑盒合成cDNA，取2 μl cDNA進行PCR擴增，逐一按照PCR的實驗步驟進行ERK1/2核酸的檢測，其中引物序列如表1所示。

表1 ERK1/2引物序列Tab 1 ERK1/2 primer sequences

2 結果

2.1 大鼠一般情況的觀察模型組大鼠于實驗開始時出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)粗糙不整、活動減少、被抓取時無抵抗、不飲食、尿黃、體質量下降，甚至伴有口鼻出血，48 h后死亡6只；MgIG 25 mg/kg組大鼠精神狀態(tài)差，身體蜷縮，甚至伴有口鼻出血，48 h后死亡4只；MgIG 50 mg/kg組及MgIG 100 mg/kg組大鼠精神、毛發(fā)、飲食、活動均較MgIG 25 mg/kg組明顯好轉，48 h后各死亡3只。

2.2 各組大鼠肝組織病理學變化正常對照組肝細胞未見變性壞死，沿中央靜脈呈放射狀排列，竇間隙輕微充血。模型組中央靜脈周圍的肝細胞大片融合、壞死，界線不清，胞質崩解形成深伊紅染色、形態(tài)不規(guī)則顆?；蛐◇w，周邊殘存的肝細胞明顯水腫，呈小泡樣脂肪變性，胞質疏松淡染。MgIG 25 mg/kg組中央靜脈周圍的肝細胞部分壞死，少部分肝細胞結構恢復。MgIG 50 mg/kg組部分肝細胞結構明顯恢復。MgIG 100 mg/kg組可見中央靜脈周圍肝細胞壞死較少，但仍有少數(shù)肝細胞體積增大，胞質疏松淡染，可見放射狀的肝索形成(見圖1)。

圖1 各組肝組織HE染色后普通光學顯微鏡下觀察病理變化(放大400倍) A：正常對照組；B：模型組；C：MgIG 25 mg/kg組；D：MgIG50 mg/kg組；E：MgIG 100 mg/kg組Fig 1 The liver tissues pathology general under optical microscope after HE staining in each group A:normal control group;B:model group;C:MgIG 25 mg/kg group;D:MgIG 50 mg/kg group;E:MgIG 100 mg/kg group

2.3 MgIG對ALF大鼠肝組織中ERK1/2、pERK1/2表達的影響Western blotting法檢測各組大鼠肝組織中ERK1/2、pERK1/2的表達情況(見圖2A)，結果分析提示：各組大鼠肝組織中ERK1/2表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2B)，模型組中pERK1/2的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)，MgIG治療組中pERK1/2的表達隨著MgIG濃度的升高逐漸下調(diào)(P<0.01)，尤其在MgIG 50 mg/kg、MgIG 100 mg/kg兩組中下調(diào)最為明顯(P<0.01)(見圖2C)。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；MgIG治療組間比較，▲▲P<0.01。圖2 MgIG對ALF大鼠肝組織中ERK1/2、pERK1/2表達的影響 A：Western blotting法檢測各組大鼠肝組織中ERK1/2、pERK1/2的表達情況；B：各組大鼠肝組織中ERK1/2的表達情況；C：各組大鼠肝組織中pERK1/2的表達情況Fig 2 Effect of MgIG on the expression of ERK1/2 and pERK1/2 in liver tissues of ALF rats A:the expression of ERK1/2 and pERK1/2 in liver tissues of rats in each group detected by Western blotting;B:the expression of ERK1/2 in liver tissues of rats in each group;C:the expression of pERK1/2 in liver tissues of rats in each group

2.4 MgIG對ALF大鼠肝組織中ERK1/2 mRNA表達的影響采用qRT-PCR法檢測大鼠肝組織中ERK1/2 mRNA的表達情況，得到ERK1/2 mRNA和β-actin基因的擴增及溶解曲線(見圖3)，結果分析如圖4所示：模型組ERK1/2 mRNA的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)，MgIG治療組中ERK1/2 mRNA的表達隨著MgIG濃度的升高逐漸下調(diào)(P<0.01)，尤其在MgIG 50 mg/kg組、MgIG 100 mg/kg兩組中ERK1/2 mRNA表達明顯下調(diào)(P<0.01)，接近正常對照組水平(P>0.05)。

圖3 qRT-PCR法檢測各組大鼠肝組織中ERK1/2 mRNA和β-actin基因的擴增及溶解曲線Fig 3 qRT-PCR method to detect each group ERK1/2 mRNA in rat liver tissue and β-actin gene amplification and dissolve curve

注：與正常對照組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MgIG 25 mg/kg組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。圖4 各組大鼠肝組織中ERK1/2 mRNA的表達情況比較Fig 4 Comparison of ERK1/2 mRNA expression in rat liver tissue in each group

3 討論

ALF病因多樣，機制復雜，但肝臟炎癥反應的過度激活和大范圍的肝細胞壞死是其主要特點，信號通路的活化在此過程中發(fā)揮著重要作用。大量實驗研究表明，信號通路的激活與ALF的發(fā)生密切相關，如核因子E2相關因子(NF-E2-related factor 2，Nrf2)[11]、核轉錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)[12]、信號傳導、轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)[13]等。因此，抑制信號通路的傳導可能成為ALF的治療靶點。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路的激活可能參與了ALF的發(fā)生[14]，這與文獻報道結果一致[15-16]。Tian等[17]通過抑制ERK1/2炎癥信號通路，使MIF-1β、IL-6、TNF、INOS等炎癥因子的蛋白表達下調(diào)，進而減輕小鼠肝纖維化炎癥反應。Gehrke等[18]發(fā)現(xiàn)，IL-1受體缺陷可使ERK1/2信號通路下調(diào)，從而降低ALF小鼠死亡率，表明ALF發(fā)生與ERK1/2信號通路活化有關。Sang等[19]發(fā)現(xiàn)，蝦青素可通過抑制ERK1/2信號通路的磷酸化對抗對乙酰氨基酚引起的ALF。這些文獻報道均說明ERK1/2信號通路的磷酸化在ALF發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

MgIG是從傳統(tǒng)中藥甘草根中提取的化合物[20]，具有親溶性高、保護肝細胞膜及抗炎的作用[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，MgIG的抗炎機制主要與減少肝臟氧化應激和促炎癥因子的產(chǎn)生有關[21，23]，但其是否可通過ERK1/2信號通路抑制肝臟炎癥，促進ALF的轉歸，目前鮮有文獻報道，需要深入研究。

本課題采用CCl4灌胃誘導的ALF大鼠模型，腹腔注射不同濃度的MgIG注射液，通過Western blotting技術檢測ERK1/2和pERK1/2的表達水平，qRT-PCR檢測ERK1/2 mRNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)實驗組各組大鼠肝組織中ERK1/2蛋白的表達與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；模型組ALF大鼠肝組織中pERK1/2、ERK1/2 mRNA的表達明顯高于正常對照組，提示ALF的發(fā)生與ERK1/2信號通路的活化密切相關。治療組ALF大鼠肝組織中pERK1/2、ERK1/2 mRNA的表達隨著MgIG濃度的升高逐漸下調(diào)，ERK1/2 mRNA的表達在MgIG 50 mg/kg組和MgIG 100 mg/kg組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義，根據(jù)大鼠肝組織病理學表現(xiàn)，MgIG 100 mg/kg組療效明顯，結果提示MgIG可通過抑制ERK1/2信號通路減輕ALF的炎癥反應，且與MgIG注射液的濃度相關。Xie等[7]的研究提示，MgIG通過抑制ERK1/2信號通路的活化，下調(diào)由脂多糖誘導的RAW264.7細胞(小鼠巨噬細胞白血病細胞)活性氧和炎癥介質的生成而發(fā)揮抗炎作用，這與本研究中發(fā)現(xiàn)的MgIG抗炎保肝的分子機制一致。而Huang等[24]在體外人肝細胞缺血/再灌注損傷模型實驗中發(fā)現(xiàn)，MgIG通過上調(diào)ERK信號通路實現(xiàn)其對肝細胞的保護作用，與本研究結果相反，故MgIG通過調(diào)控ERK1/2信號通路發(fā)揮抗炎保肝的確切分子機制還需深入研究。

綜上，ALF發(fā)生發(fā)展與ERK1/2信號通路的活化有關，而MgIG可以通過抑制ERK1/2信號通路明顯減輕CCl4誘導的肝臟炎癥，促進ALF的轉歸，這為進一步探究其具體機制、研發(fā)以ERK1/2信號通路為靶點的抗炎保肝藥物提供了理論依據(jù)和實驗基礎。