胡瑤 雷星宇 李宏告 張勇 周毅吉 李麗輝

（湖南省農業(yè)科學院核農學與航天育種研究所 長沙410125）

梔子花（Gardenia jasminoides Ellis）為茜草科梔子屬常綠灌木或小喬木，又名山梔子、黃梔子，產于我國長江流域，喜溫暖濕潤環(huán)境。梔子花芳香馥郁，色澤潔白，且花含揮發(fā)油，可提制浸膏，作調香劑，果實可作黃色染料，根、花、種子可入藥，具有重要的經濟價值和觀賞價值［1］。

但國內適合商品化生產的品種還很少，新品種選育顯得尤為迫切。輻照誘變育種和組織培養(yǎng)相結合的育種體系是近年來研究者普遍關心的育種方法，它可以提高植物在基因水平上的突變率，有利于打破性狀連鎖和促進基因重組，擴大植物的變異范圍，減小親本對變異類型的限制，縮短育種年限，最終促進新種質的產生［2-3］。

目前，輻射誘變技術在植物新品種培育及品種性狀改良等領域已得到廣泛應用，而組織培養(yǎng)在植物快速繁殖方面也普遍應用。輻照誘變育種主要采用X射線、60Co γ 射線、電子束等對花卉進行輻照。Ahloowalia 等［4］采用軟X 射線對50 個品種的杜鵑進行輻照誘變育種，最終發(fā)現(xiàn)31%的植株都產生了嵌合體變異的情況；齊文全等［3］研究結果表明，60Co γ射線對不同庭院月季品種扦插苗的最適吸收劑量為45 Gy，該劑量范圍內，月季扦插苗既能保持一定的生長，又具有較高的變異頻率；王晶等［5］利用60Co γ射線對菊花組培苗進行輻射處理，結果表明輻照后的變異花增加了不同深淺的紅色素，且突變植株均為同質穩(wěn)定突變；林兵等［6］的研究表明，60Co γ輻射誘變可以作為荷蘭鳶尾新品種培育的有效途徑；朱宗文等［7］研究電子束對番茄種子的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著電子束劑量的增加，番茄種子的發(fā)芽率逐漸降低，當劑量為600 Gy 時，黃盆栽和1479 種子發(fā)芽率分別為對照組（CK）的97.2%和77.2%；彭穎［8］采用60Co γ射線對梔子組織培養(yǎng)愈傷組織進行不同吸收劑量的射線處理，結果表明梔子的半致死劑量為40 Gy左右，致死劑量為60 Gy左右，還發(fā)現(xiàn)其染色體發(fā)生了明顯變異，變異率以40 Gy處理最高。

綜上可知，60Co γ 射線用于植物輻照誘變育種效果較好，但關于梔子輻照誘變結合組織培養(yǎng)的報道尚為少見，如對于吸收劑量、輻射時間對梔子種子組培培養(yǎng)生長和發(fā)育的影響以及輻射后植株的變異情況鮮見報道。本研究以“林海1 號”、武岡野生梔子果實為試材，進行60Co γ射線輻射并結合組織培養(yǎng)系列試驗，探討輻照對兩種梔子種子組織培養(yǎng)的影響，得出半致死劑量，為進一步選育優(yōu)良梔子品種資源奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為汨羅基地栽培梔子“林海一號”和武岡野生梔子引種栽培第二年收獲的成熟果實，采收后自然曬干，陰涼處存放。

1.2 輻照處理

將兩種梔子果實分別采用自封袋分裝后，送往湖南省核農學與航天育種研究所生物輻照中心進行輻射處理，劑量分別為0 Gy、20 Gy、40 Gy、60 Gy，每組8個樣品。

1.3 組織培養(yǎng)

將輻照后的果實浸泡24 h，取出種子接種到分化培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L）中培養(yǎng)，并誘導植株再生（生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 2.0 mg/L）。各劑量組培養(yǎng)5 瓶，每瓶5 粒種子。具體指標測定方法見式（1）～（7）。

1.4 輻照后組培苗葉片氣孔結構分析

當組培苗葉片長至6片葉時，分別從不同輻照處理葉片中隨機采集三個2 mm×2 mm 樣品，將樣品固定于體積分數(shù)2.5%的戊二醛（0.1 mol/L 磷酸緩沖液，pH為7.0），置于4 ℃下冷藏保存3 d，用磷酸緩沖液沖洗6 次，用體積分數(shù)1%鋨酸固定3 h，用相同磷酸緩沖液沖洗干凈。將組織在分級乙醇中進行脫水，臨界點干燥，再在觀察臺上固定，利用高壓涂膜裝置進行噴金處理。對單個氣孔在Quanta 200 掃描電子顯微鏡（FEI Corp，USA）下觀察和拍照［9］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 進行方差分析，以Duncan's進行多重比較，以Excel 2019繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 輻照對兩種梔子種子啟動培養(yǎng)的影響

表1中均為培養(yǎng)45 d后的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

表1 不同劑量60Co γ輻射對兩種梔子種子啟動培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of different absorbed doses on the start training of two kinds of gardenia

由表1 可以看出，60Co γ 射線輻照對兩種梔子種子啟動培養(yǎng)均產生了不同程度的影響?！傲趾Ｒ惶枴睏d子種子4個處理均未出現(xiàn)污染的情況，而經輻照后的種子組培出愈率逐漸降低，其中60 Gy處理的褐化率最高，出愈率最低，20 Gy輻照處理的“林海一號”種子出愈率最高。武岡野生梔子在40 Gy輻照處理下出愈率達到72%，較CK高出28%。60 Gy處理的“林海1號”梔子種子比武岡野生梔子種子總體出愈率高。

2.2 輻照對兩種梔子不定芽分化的影響

將顏色翠綠、長勢良好的梔子愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基中，再進行不定芽的誘導試驗。每組10 瓶，每瓶接入5 塊愈傷組織，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計結果。經過輻照處理的兩種梔子出苗率均比對照低。但武岡野生梔子40 Gy 處理較20 Gy 處理出苗率又顯著上升?！傲趾? 號”和武岡野生梔子均為60 Gy 處理出苗率最低，比對照組分別下降了65.19%和58.38%，呈顯著性差異。武岡野生梔子出苗率除20 Gy 處理略低于“林海1 號”梔子外，其余各處理出苗率均高于“林海一號”梔子。

圖1 不同劑量60Co γ輻射對兩種梔子不定芽分化的影響Fig.1 Effects of different absorbed doses on adventitious bud differentiation of two kinds of gardenia

2.3 輻照對兩種梔子不定根分化的影響

從增殖培養(yǎng)中選擇梔子不定芽生長健壯且高度大于2 cm 的組培苗進行生根誘導。接種30 d 后的調查結果見表2 和圖2。由表2 和圖2 可知，“林海1號”梔子生根率隨著劑量的增大而降低，劑量達到60 Gy時，生根率明顯低于其他處理組和對照組。40 Gy 處理的“林海1 號”梔子組培苗平均苗高最高，較對照和60 Gy處理組呈顯著差異，其根系較發(fā)達。而劑量達到60 Gy 時，“林海1 號”梔子平均苗高最矮，根系短，數(shù)量少，長勢也一般。武岡野生梔子生根率CK 最高，60 Gy 處理最低，各處理間差異顯著。40 Gy 處理的組培苗長勢好，且平均苗高最高，根系較發(fā)達，平均根長最長，與對照存在顯著差異。但整體長勢較“林海1 號”差。兩種梔子在60 Gy輻照處理下發(fā)生了株高明顯矮化現(xiàn)象，較對照差異顯著。

2.4 輻射對兩種梔子葉片氣孔開度的影響

取兩種經不同吸收劑量處理的梔子組培苗幼嫩葉片作電鏡制片，比較輻照后的葉片與對照葉片的氣孔形態(tài)及大小，其結果見圖3。從已張開的氣孔形態(tài)來看，經輻照處理的“林海1號”梔子葉片氣孔張開程度較對照大，且均出現(xiàn)不同程度的皺縮，60 Gy處理的最為明顯。武岡野生梔子經輻照處理的葉片氣孔也呈現(xiàn)不同程度的變化。20 Gy處理的氣孔變小，保衛(wèi)細胞和副衛(wèi)細胞出現(xiàn)皺縮；40 Gy處理的氣孔張開程度變化不大，但保衛(wèi)細胞皺縮程度最大；60 Gy處理的氣孔內壁變薄，外壁變化不大，副衛(wèi)細胞皺縮明顯。從表3 可以看出，“林海1 號”梔子輻射后葉片的氣孔都有不同程度的增大，保衛(wèi)細胞寬度變寬，氣孔打開程度以60 Gy處理為最大，與對照呈顯著差異。武岡野生梔子輻射后葉片氣孔變化與“林海1 號”不同，其中40 Gy 處理的氣孔長寬及氣孔開度均比對照大，20 Gy和60 Gy 處理的氣孔長寬及氣孔開度則均比對照小，處理后的葉片氣孔保細胞寬度均比對照寬，但差異不顯著。

3 討論

用輻射方法結合組織培養(yǎng)技術使得育種效率明顯增高，是植物新種質選育快速有效的方法之一，劑量是60Co γ射線誘變育種應用過程中的一個重要因素，在一定范圍內，增大吸收劑量可提高突變頻率，擴大變異譜，但過高的劑量會使致死率提高，不良畸變率增大［10-11］。本文采用60Co γ 射線對“林海1號”梔子、武岡野生梔子果實進行輻招處理，并進行組織培養(yǎng)。結果表明：隨著60Co γ吸收劑量的增加，“林海1 號”出愈率降低、而武岡野生梔子40 Gy處理的出愈率升高，說明一定劑量的輻照處理對武岡野生種子的萌發(fā)具有促進和刺激作用。這與周亞倩和Stotzky 等［12-13］的研究結果一致：低劑量輻照可促進樹蘭、香蕉種子的萌發(fā)，縮短萌發(fā)時間、提高萌發(fā)率。耿興敏等［14］在研究60Co γ射線對桂花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響中也發(fā)現(xiàn)，較低劑量的輻照可以提高潢川金桂、籽銀桂和短柄籽銀桂種子的發(fā)芽率。在杉木、紫薇、鳶尾［15-17］等種子輻射育種研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。

大量研究表明：60Co γ 射線輻照會引起植物形態(tài)損傷或死亡，在誘變育種中，劑量過低達不到誘變效果，隨著吸收劑量的增加，植株突變率也會相應提高，但劑量過高，植株正常的代謝會受到干擾，畸變率及死亡率都會增加，通常將半致死劑量作為吸收劑量選擇的重要參考依據(jù)［18-19］。如Luz 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，150 Gy 和250 Gy 均能引起藜麥發(fā)生突變，并且突變率隨劑量而增大，350 Gy則導致藜麥品種Pasankalla 全部死亡。陳睿等［21］以兩種杜鵑為材料研究輻射效應，發(fā)現(xiàn)在25～65 Gy內隨著吸收劑量增大，花的變異率增加，花色和花瓣形態(tài)出現(xiàn)多樣性。本研究中兩種梔子輻照后不定芽分化率、生根率均呈下降趨勢，“林海1號”半致死劑量為40～60 Gy；武岡野生梔子半致死劑量為40 Gy左右，說明不同植物品種或類型由于存在遺傳差異而對輻照的敏感性不同，即使是同種植物的不同生長狀態(tài)也對輻照的敏感性不同。

本研究還對輻射后的梔子組織培養(yǎng)出來的葉片進行氣孔結構觀察，“林海1號”梔子經60Co γ射線輻照后，組培苗氣孔打開程度均比對照組大，這可能是輻照對植株造成的傷害需要加大呼吸作用，則張大氣孔進行自我調節(jié)，加強代謝以修復射線對植株的損傷，這與李黎等［22］研究結果一致。武岡野生梔子則是40 Gy處理后，氣孔開度增大顯著，這可能是武岡野生梔子耐受劑量的一個轉折點。本次試驗發(fā)現(xiàn)的梔子輻射組培苗矮化、氣孔形態(tài)皺縮等變異情況，是否為基因組的突變，需要下一步進行驗證。

4 結論

60Co γ射線輻射處理對“林海1號”、武岡野生梔子種子組織培養(yǎng)、組培苗葉片氣孔結構的影響差異較大。其中，“林海1 號”半致死劑量為40～60 Gy，武岡野生梔子半致死劑量約為40 Gy。因此，梔子育種可利用60Co γ射線結合組織培養(yǎng)方法進行輻射誘變，為今后為梔子輻射誘變育種提供一定的理論依據(jù)。