蔡洲，肖琛嫦，梅燕

（武漢科技大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北 武漢 430083）

0 引言

肺腺癌是一種非小細(xì)胞肺癌，主要起源于支氣管黏膜上皮[1-2]。目前，肺腺癌的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，大量的醫(yī)學(xué)資料表明吸煙、環(huán)境污染、放射、肺部慢性疾病及內(nèi)分泌失調(diào)等均可能誘發(fā)肺腺癌發(fā)生。S100A6 屬于S100 蛋白家族，能夠通過(guò)靶蛋白參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，是一種與腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的重要標(biāo)志物[3-4]。南巖東[5]等人在研究中提到，S100A6 在判斷正常肺組織和肺癌方面具有高靈敏度和特異度，診斷準(zhǔn)確率由于其他腫瘤標(biāo)志物，可作為肺腺癌早期診斷與預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。本研究將肺腺癌細(xì)胞組織的表型特征作為研究重點(diǎn)，旨在明確S100A6 基因表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞組織的影響，為臨床上確定S100A6 的主要作用機(jī)制提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年5 月至2018 年2 月某院收治的34例肺腺癌患者的正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織標(biāo)本，其中男18 例，女16 例，年齡23～78 歲，平均（52.6±3.8）歲。A549 肺腺癌細(xì)胞由上海中科院提供。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

將A549肺腺癌細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液中（含100g/L 胎牛血清+100U/mL 青霉素+100μg/mL 鏈霉素），培養(yǎng)一段時(shí)間后將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，細(xì)胞融合60%后轉(zhuǎn)染攜帶S100A6 基因+綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，構(gòu)建S100A6 陽(yáng)性組。

1.2.2 S100A6 蛋白表達(dá)量檢測(cè)方法

在標(biāo)本勻漿中加入細(xì)胞裂解液，離心15min 后取上層清液，采用BCA 蛋白定量法進(jìn)行測(cè)定。使用聚丙烯酰胺進(jìn)行常規(guī)電泳，使用一抗4℃下孵育過(guò)夜，二抗室溫條件下孵育2h，采用化學(xué)熒光發(fā)光法進(jìn)行顯色處理。S100A6 蛋白表達(dá)量=條帶吸光度值/GAPDH 吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè)方法

采用MTT 法測(cè)定肺腺癌細(xì)胞增殖率，使用培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）配置細(xì)胞懸液，以1000～10000個(gè)細(xì)胞/孔接種至96 孔板上，細(xì)胞生長(zhǎng)60%后96h吸出，每孔加20μlMTT 溶液，孵育4h，吸除上層清液后加入150μl 二甲基亞砜，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定吸收值。取100μl 300mL/L 的無(wú)血清培養(yǎng)液，均勻涂抹在PET 膜表面，將生長(zhǎng)期細(xì)胞濃度調(diào)整為105/mL，48h 后進(jìn)行常規(guī)固定、染色，計(jì)算PET 膜下穿膜細(xì)胞數(shù)，取5 個(gè)視野平均值。對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行PSB溶液洗滌和胰酶細(xì)胞消化液消化處理，貼壁細(xì)胞掉落后吸除消化液，離心5min 后去除上層清液，使用PBS 溶液重懸細(xì)胞。取50000～100000 重懸細(xì)胞，離心5min 后加入Annexin V-FITC 溶液及染色液，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并記錄S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織的表達(dá)量，比較陽(yáng)性組和陰性組的細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量結(jié)果比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織的表達(dá)差異

S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織、肺腺癌組織的表達(dá)量分別為（0.247±0.069）、（0.486±0.213）、（0.796±0.328），見(jiàn)表1。

表1 S100A6 基因在正常肺組織、癌旁組織及肺腺癌組織的表達(dá)差異

2.2 S100A6 陽(yáng)性組和陰性組細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較

陽(yáng)性組的細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯高于陰性組，細(xì)胞凋亡率顯著低于陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 S100A6 陽(yáng)性組和陰性組細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較

2.3 S100A6 陽(yáng)性組和陰性組細(xì)胞周期比較

陽(yáng)性組肺腺癌細(xì)胞S 期占（56.27±0.93）%，G2-M 期占（4.92±0.36）%，陰性組肺腺癌細(xì)胞S 期占（42.53±0.71）%，G2-M 期占（18.01±0.42）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽(yáng)性組和陰性組的G0-G1 期肺腺癌細(xì)胞比例無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 S100A6 陽(yáng)性組和陰性組細(xì)胞周期比較（%）

3 討論

肺腺癌是一種腺上皮惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為圓形或橢圓形腫塊，具有生長(zhǎng)緩慢、可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[6-7]。早期肺腺癌并不明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為咳嗽、胸悶、咯血、胸痛等一般呼吸系統(tǒng)癥狀，易被忽略。隨著疾病的不斷發(fā)展，患者開(kāi)始出現(xiàn)胸痛、聲音嘶啞、面頸部水腫、胸腔積液等晚期癥狀。由于肺腺癌在早期階段即可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，如未得到及時(shí)有效的診斷和治療極有可能發(fā)生急速惡化現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。S100A6 是一種酸性蛋白質(zhì)，最早于腹水瘤組織中被發(fā)現(xiàn)，以螺旋結(jié)構(gòu)為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要廣泛分布與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核被膜及核膜表面，與十多種蛋白質(zhì)存在直接的作用關(guān)系[8-10]。大量的研究證實(shí)，S100A6 基因在多種惡性腫瘤中出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，可能是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要物質(zhì)[11-12]。本研究數(shù)據(jù)顯示，與正常肺組織相比，癌旁組織和肺腺癌組織中的S100A6 蛋白表達(dá)量明顯升高，且肺腺癌組織中含量最高，提示S100A6 基因在肺腺癌細(xì)胞組織中呈過(guò)度表達(dá)。這是因?yàn)镾100A6 是一種單拷貝基因，定位于I21 染色體上，該染色體在腫瘤分布區(qū)域存在明顯的缺失或重排現(xiàn)象，與腫瘤存在密切的相關(guān)性。目前，S100A6 基因在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的共識(shí)，但其與腫瘤細(xì)胞組織的關(guān)系尚待研究。本研究對(duì)肺腺癌細(xì)胞組織的表型特征進(jìn)行了對(duì)比性分析，結(jié)果如下。

本次研究通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建S100A6 陽(yáng)性肺腺癌細(xì)胞株，并采用MTT 法檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞增殖率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A6 陽(yáng)性組肺腺癌細(xì)胞增殖率高達(dá)（57.49±1.35）%，明顯高于陰性組的（40.12±1.28）%，提示S100A6 基因表達(dá)可能通過(guò)提高癌細(xì)胞增殖率參與腫瘤發(fā)展。既往的研究認(rèn)為，S100A6 能夠通過(guò)與肌動(dòng)蛋白、調(diào)鈣蛋白和原肌球蛋白相互作用改變細(xì)胞骨架，從而影響癌細(xì)胞黏附能力，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13-14]。在進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)S100A6 陽(yáng)性組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于陰性組，表明S100A6 基因表達(dá)可對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，通過(guò)提高肺腺癌細(xì)胞遷移能力促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。除了細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移能力外，細(xì)胞凋亡情況也是評(píng)價(jià)腫瘤發(fā)展情況的重要指標(biāo)之一。研究結(jié)果顯示S100A6 陽(yáng)性組的肺腺癌細(xì)胞凋亡率僅為（1.24±0.38）%，明顯低于陰性組，表明S100A6 基因的表達(dá)能夠在一定程度上抑制癌細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)癌癥加重。一般情況下，腫瘤的發(fā)生是因?yàn)閻盒赞D(zhuǎn)化的癌細(xì)胞過(guò)度增殖引起，但從細(xì)胞凋亡的角度來(lái)看，腫瘤細(xì)胞打破了有序死亡秩序，凋亡機(jī)制收到影響而無(wú)法進(jìn)行正常的死亡清除[15]。S100A6 基因的過(guò)度表達(dá)使得肺腺癌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低，可能通過(guò)干擾癌細(xì)胞凋亡機(jī)制發(fā)揮作用。本次研究發(fā)現(xiàn)，S100A6 陽(yáng)性組肺腺癌細(xì)胞S期占（56.27±0.93）%，明顯高于陰性組，而G2-M期僅占（4.92±0.36）%，與陰性組比較差異顯著（P＜0.05）。膜聯(lián)蛋白XI 是細(xì)胞內(nèi)S100A6 蛋白的主要靶蛋白之一，肺腺癌細(xì)胞從分裂前期、間期到分裂中前期，膜聯(lián)蛋白XI 借助細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化逐漸從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核膜，與S100A6 完成匯合。至分裂中后期，細(xì)胞核膜開(kāi)始崩解，S100A6和膜聯(lián)蛋白XI 共同沉積在鏈接細(xì)胞核膜和多肽的片層位置，分裂后期膜聯(lián)蛋白XI 參與核膜重建，分裂間期重歸細(xì)胞核，而S100A6 則在分裂中后期至分裂末期階段進(jìn)行降解。S100A6 陽(yáng)性組的肺腺癌細(xì)胞主要集中于S 期，是DNA 合成和組蛋白合成的主要階段，表明S100A6 基因表達(dá)能夠改變肺腺癌細(xì)胞分裂周期，使大多數(shù)癌細(xì)胞處于DNA合成期，從而參與腫瘤發(fā)展、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，S100A6 基因在肺腺癌細(xì)胞組織內(nèi)過(guò)度表達(dá)，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡，并通過(guò)提高癌細(xì)胞遷移能力促使癌灶擴(kuò)散。