唐曉琴，陳平博，袁婷婷，趙海東，劉世榮，張 宇，孫秀柱

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，楊凌 712100)

近年來，隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，肉質(zhì)細嫩，可御風(fēng)寒、補氣血的羊肉漸漸受到了消費者的青睞。其中同羊作為陜西省優(yōu)質(zhì)肉羊品種，市場需求量也在逐年增加[1]。但由于同羊群體數(shù)量少，優(yōu)質(zhì)同羊肉供不應(yīng)求，且同羊個體間表型差異較大，因此需要對其生長性狀進行科學(xué)系統(tǒng)的選育，以提高整個品種的生產(chǎn)優(yōu)勢[2-3]。利用分子標記輔助育種技術(shù)來進行同羊的選育，對同羊品種的發(fā)展及遺傳資源多樣性的保護具有重要的意義。

腫瘤相關(guān)抗原1（Ewing tumor associated antigen 1,ETAA1）是一種與人的脂肪分布相關(guān)的重要基因[4]。Ma 等人的研究表明ETAA1基因可能與綿羊尾部脂肪發(fā)育有關(guān)[5]。Wang 等的研究發(fā)現(xiàn)該基因在肥尾和短尾綿羊脂肪組織中也有差異表達[6]。ETAA1是ATR 激酶激活物，ATR 激酶是一種DNA修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，在感受到DNA 損傷的跡象后ATR激酶就會活化細胞的修復(fù)系統(tǒng)。ETAA1可以通過調(diào)節(jié)ATR 維持基因組穩(wěn)定性[7-13]。Mills 等的研究表明，較小的InDel 變異可能是人類遺傳特征和疾病的關(guān)鍵因素[14]，因此推測ETAA1基因中的InDel 也可能通過影響基因組穩(wěn)定性等對綿羊的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。本試驗以同羊為研究對象，檢測基因ETAA1中潛在的InDel 位點，并對其與同羊的生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，篩選影響同羊生長發(fā)育的分子標記，為同羊肉用性狀的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采樣

本試驗以陜西白水同羊原種場中166 只無任何親緣關(guān)系的同羊為研究對象，使用真空采血管對同羊進行頸靜脈采血，使其與EDTA 充分混合后將血樣置于-80 ℃的環(huán)境中保存以便長期使用。對采集血液的同羊進行體尺性狀的測量并記錄，包括體高、體長、薦高、背高、臀端高、胸深、胸寬、腰角寬、臀端寬、頭長、頭深和管圍等。此外，對脂尾的長度和寬度以及周長測量并記錄。

1.2 血液DNA 的提取和均質(zhì)化

1.2.1 血液DNA 的提取 使用全血基因組DNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取同羊血樣DNA，試驗步驟參照試劑盒說明書進行。

1.2.2 血液DNA 數(shù)量和質(zhì)量檢測及均質(zhì)化 使用Nanodrop 2000 檢測DNA 濃度，所有同羊樣品DNA的濃度均大于50 ng·μL-1，OD260/280均在1.8 左右，OD260/230均在2.0 以上，記錄測定結(jié)果。將每個DNA原液抽取30 μL 用雙蒸水均質(zhì)化到50 ng·μL-1，編號并記錄。

1.3 引物設(shè)計及PCR

登錄 Ensembl 數(shù)據(jù)庫（http:// asia.ensembl.org/index.html），在綿羊基因組中找到基因ETAA1潛在的大于6 bp 的 InDel 位點，查找并下載該InDel 位點前后300～500 bp 的序列。根據(jù) InDel位點前后300～500 bp 的序列，使用Primer Premier Software（5.0）設(shè)計相應(yīng)的引物，并使用NCBI Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/)驗證引物特異性。ETAA1基因的特異性引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

表2 TD-PCR 程序Table 2 Touch Down-PCR program

將同羊DNA 稀釋到工作濃度，從已稀釋的DNA 樣中隨機挑選24 個樣品構(gòu)建混池。并以此作為模板進行PCR 和瓊脂糖凝膠電泳。qPCR 擴增體系（25 μL）：2× Taq Master Mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR程序見表2。將經(jīng)過PCR 擴增后的產(chǎn)物利用2.5%～3%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分型（120 V，60 min）。記錄分型結(jié)果。得到分型結(jié)果后，3 種基因型各隨機挑選10 個樣本的PCR 產(chǎn)物送至上海生工進行測序，驗證瓊脂糖凝膠電泳分型結(jié)果的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計同羊ETAA1基因InDel 的分型結(jié)果、生長性狀及脂尾性狀，利用線性模型來確定基因型與同羊各個生長性狀及脂尾之間的關(guān)系，基本線性模型如下。

其中Yi為每只同羊的生長性狀測量數(shù)據(jù)，μ為總體均值，Gi為基因型的效應(yīng)，e為隨機誤差。使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析[15]，結(jié)果用“平均值±標準差”表示；利用在線軟件MSR（http://www.msrcall.com/Gdicall.aspx）對變異位點進行基因型統(tǒng)計和哈代溫伯格平衡檢驗；統(tǒng)計ETAA1基因InDel 位點的基因型和等位基因頻率分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 ETAA1 基因InDel 檢測

根據(jù)NCBI 公布的ETAA1參考基因組設(shè)計擴增潛在InDel 位點前后片段的特異性引物，進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，ETAA1基因的InDel位點存在3 種基因型，分型結(jié)果見圖1（a），泳道1、2 和5 為213 bp 條帶大小的DD 型，泳道4 為225 bp條帶大小的II 型，泳道3 為213 bp 和225 bp 條帶大小的ID 型；3 種基因型各隨機挑選10 個個體的PCR 產(chǎn)物進行測序，驗證瓊脂糖分型結(jié)果準確性，測序結(jié)果與瓊脂糖分型結(jié)果一致，見圖1（b）。

對ETAA1基因InDel位點的基因型和等位基因頻率進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，該InDel 位點中DD 基因型頻率為0.500 0，II 基因型頻率為0.090 4。DD 基因型為優(yōu)勢基因型。I 和D 的等位基因頻率分別為0.295 2 和0.704 8，對群體進行遺傳參數(shù)估計發(fā)現(xiàn)該位點基因純合度為0.583 9，雜合度為0.416 1，有效等位基因數(shù)為1.712 6，多態(tài)信息含量為0.329 5，處于中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5），同時也處于Hardy-Weinberg 平衡中（P＞ 0.05）（表3）。

圖1 同羊ETAA1 基因InDel 的電泳分型條帶(a)和測序結(jié)果(b)Figure 1 Electrophoresis typing bands(a) and sequencing results(b) of ETAA1 gene InDel in Tong sheep

表3 同羊ETAA1 基因InDel 位點遺傳多態(tài)性Table 3 Genetic polymorphism of InDel of ETAA1 gene in Tong sheep

表4 ETAA1 基因InDel 位點對同羊公羊生長性狀及尾脂的影響Table 4 Effect of ETAA1 gene InDel locus on growth traits and tail trait of the Tong sheep ram

表5 ETAA1 基因InDel 位點對同羊母羊生長性狀及尾脂的影響Table 5 Effect of ETAA1 gene InDel locus on growth traits and tail trait of the Tong sheep ewe

2.2 InDel 位點與同羊生長性狀關(guān)聯(lián)分析

利用SPSS 22.0 軟件將同羊ETAA1基因InDel位點多態(tài)性分別與同羊不同性別生長性狀及其尾脂進行關(guān)聯(lián)分析，其中生長性狀包括體高、體長、薦高、背高、臀端高、胸深、胸寬、腰角寬、臀端寬、頭長、頭深、管圍、尾長和尾寬。結(jié)果分析了InDel位點3 種不同基因型對應(yīng)的不同生長性狀及尾脂測量數(shù)據(jù)之間的差異。結(jié)果表明，同羊ETAA1基因的InDel 位點在公羊臀端高這一生長性狀上II 基因型顯著高于DD 基因型與ID 基因型（P＜ 0.05），對公羊與母羊尾脂性狀無顯著影響 （P ＞0.05）（表4，表5）。

3 討論與結(jié)論

通過對有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）數(shù)值的分析，可以檢測出目標基因的遺傳多樣性和遺傳潛力。本研究中，同羊有效等位基因數(shù)為1.712 6，這表明該基因多態(tài)在同羊群體中分布較為不均勻。哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg）檢測發(fā)現(xiàn)同羊群體中處于哈代-溫伯格平衡之中（P＜ 0.05），多態(tài)信息含量分析發(fā)現(xiàn)在同羊群體中該位點 PIC 為0.329 5，介于0.25 和0.5 之間，處于中度多態(tài)，說明該基因變異較大，在選育中有較大選擇潛力。

InDel 指在同一物種不同個體間相同的DNA 序列上發(fā)生的片段插入或者缺失，由于不同個體間存在差異，所以可以作為多態(tài)分子標記，具有重復(fù)性高，特異性好的特點，InDel 多態(tài)性也常常與動物的生長發(fā)育有關(guān)[16-18]。ETAA1是在腫瘤細胞或正常細胞上存在的抗原分子，常用于臨床腫瘤的診斷。正常細胞可微量合成，而在腫瘤細胞增殖時高度表達。ETAA1作為ATR 激酶激活劑，通過激活A(yù)TR 來控制細胞周期進程，DNA 損傷時進行DNA 修復(fù)和凋亡[19-20]。Miosge 等研究發(fā)現(xiàn)ETAA1突變的小鼠在接種疫苗后會產(chǎn)生具有缺陷的效應(yīng)T 細胞反應(yīng)[21]。Osiński 等通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)ETAA1基因rs4141819 SNP 與不孕癥相關(guān)[22]。Yu 等發(fā)現(xiàn)ETAA1基因位點突變與遺傳性非息肉性大腸癌相關(guān)[23]。Childs 等發(fā)現(xiàn)ETAA1基因rs1486134 SNP 與胰腺癌有著顯著相關(guān)性[24]?；谏鲜鲅芯?，可以得知ETAA1可能和DNA 修復(fù)、細胞周期控制，胚胎發(fā)育等生理過程以及腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，據(jù)此推測ETAA1基因可能會通過影響細胞生命活動從而影響家畜的生長發(fā)育。現(xiàn)在已經(jīng)有大量研究證明基因多態(tài)性與家畜的生長性狀有著密切的聯(lián)系，閆海龍等的研究發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊GHR基因的InDel 顯著影響了山羊的生長性狀[25]。楊華等發(fā)現(xiàn)豬的IGFBP2基因第2 內(nèi)含子上的SNP 位點與豬的背膘厚、眼肌高、眼肌寬和骨率等性狀呈極顯著相關(guān)[26]。陶薩茹拉等的研究表明綿羊BMP15基因第一外顯子的B2、B4 位點多態(tài)性與綿羊繁殖性狀有關(guān)[27]。高曄等發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊中β-catenin基因的一個InDel 的位點與陜北白絨山羊胸深顯著相關(guān)[28]。Zhang 等發(fā)現(xiàn)肉牛SIRT4基因的InDel 對生長性狀有著顯著影響[29]。以上這些研究都表明了基因多態(tài)性可能會對家畜的生長性狀產(chǎn)生影響。本研究在基因ETAA1中篩選出了一個位于內(nèi)含子區(qū)域的插入12 bp 的InDel 突變，并對該InDel 位點多態(tài)性與同羊的生長性狀及其尾脂性狀進行了分析。該位點盡管存在于非編碼區(qū)，但研究內(nèi)含子對于編碼序列和蛋白質(zhì)的調(diào)控都有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子通過與DNA、RNA 或蛋白質(zhì)相互作用參與RNA 的生成與加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重塑等過程，進而在細胞增殖、分化和機體正常發(fā)育過程以及疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[30]。研究結(jié)果顯示該InDel 位點多態(tài)性對同羊尾脂性狀并無顯著影響，而InDel 位點不同基因型與公羊臀端高性狀顯著相關(guān)（P＜ 0.05），且該位點II 基因型的公羊臀端高顯著高于ID 和DD 基因型（P＜ 0.05），表明II基因型對同羊公羊的臀端高具有一定的正向調(diào)節(jié)作用。因此，該InDel 位點可以作為同羊生長性狀的有效分子標記，為今后更好地開展同羊分子育種研究提供參考。

本研究在ETAA1中檢測到一個InDel 多態(tài)性位點，該InDel 位點與同羊公羊生長性狀臀端高顯著相關(guān)（P ＜0.05），II 基因型的臀端高顯著高于ID 和DD基因型。因此該位點可以作為同羊生長性狀的候選分子標記，為同羊的育種提供了一定的理論基礎(chǔ)。