趙立華 朱陽(yáng)陽(yáng)，2 邱潤(rùn)霜，2 李博文，2 李 靖 董家紅，3*

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650233；2 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；3 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500）

番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（tomato zonate spot virus，TZSV）屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），于2008年在云南紅河首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道（Dong et al.，2008）。TZSV 具有與該屬的番茄斑萎病毒（tomato wilt spotted virus，TSWV）一樣典型的病毒粒體特征：球形，直徑80～120 nm，具有雙層脂膜組成的包膜（鄭寬瑜 等，2015）。TZSV 寄主廣泛，自然狀態(tài)下可侵染茄科、菊科、豆科、鳶尾科等34 個(gè)科共166 種植物，既可通過(guò)汁液摩擦接觸傳播，也可通過(guò)煙薊馬和西花薊馬等昆蟲(chóng)介體以持久增殖的方式進(jìn)行傳播（Dong et al.，2010；趙繞芬和王小兵，2012；Liu et al.，2014）。植物感染TZSV 后，感病植株葉片通常出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋壞死斑，果實(shí)出現(xiàn)明顯同心環(huán)斑，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)伴隨植株矮化、頂芽萎蔫下垂，植株無(wú)果，嚴(yán)重時(shí)可造成病害發(fā)生地絕收（尹躍艷 等，2008；Dong et al.，2013）。目前，TZSV 在云南紅河、文山、石林等地對(duì)辣椒、番茄、煙草、花卉等作物造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

病毒病是辣椒栽培生產(chǎn)上的主要病害，危害嚴(yán)重的主要病毒有番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯Y病毒（potato virusY，PVY）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）、番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）等近50 種病毒（郭思瑤 等，2015）。TZSV 的暴發(fā)嚴(yán)重影響了辣椒的生產(chǎn)，不僅使果實(shí)品質(zhì)變差，商品價(jià)值降低，同時(shí)也造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。農(nóng)業(yè)防治和物理防治方法不能長(zhǎng)期有效控制TZSV 的蔓延，而施用化學(xué)藥劑易對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅（Turina et al.，2016）。朱陽(yáng)陽(yáng)等（2019）在大田試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同辣椒品種田間對(duì)辣椒病毒病表現(xiàn)出明顯抗性差異，選育抗病品種是控制病毒病最有效的措施之一，在辣椒生產(chǎn)基地和病毒病常發(fā)地區(qū)，應(yīng)種植抗病毒或耐病毒的優(yōu)良品種。我國(guó)辣椒病毒病的研究基礎(chǔ)薄弱，目前鮮見(jiàn)抗TZSV 的種質(zhì)資源報(bào)道，且栽培辣椒品種繁多，導(dǎo)致發(fā)病地區(qū)盲目選擇辣椒品種。本試驗(yàn)對(duì)我國(guó)40個(gè)辣椒栽培品種進(jìn)行TZSV 抗性評(píng)價(jià)，以期為發(fā)病地區(qū)選擇辣椒品種提供指導(dǎo)，有效降低病害帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試?yán)苯菲贩N信息詳見(jiàn)表1。TZSV 毒源分離株采自云南石林煙草，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所作物病毒研究與應(yīng)用團(tuán)隊(duì)保存和提供。TZSV 單克隆抗體由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所作物病毒研究與應(yīng)用團(tuán)隊(duì)制備提供。

表1 參試?yán)苯菲贩N及信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒接種 將保存于-80 ℃冰箱的TZSV感染病樣接種于5～6 葉期的本生煙（Nicotiana benthamiana）上，5～7 d 后接種葉的上位葉（系統(tǒng)葉）出現(xiàn)黃色同心環(huán)紋、環(huán)形帶狀白綠相間褪綠斑點(diǎn)時(shí)，分別采集其系統(tǒng)葉，加入接種緩沖液進(jìn)行研磨，研磨成汁液后待用。使用感病植物汁液進(jìn)行接種，接種濃度為100 mg·mL-1。

試驗(yàn)于2017年5—12 月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。辣椒幼苗栽種于腐質(zhì)土∶蛭石∶珍珠巖=2V∶1V∶1V的土壤中，白天溫度設(shè)置為26 ℃，14 h；夜間溫度為24 ℃，10 h。待幼苗生長(zhǎng)至4～5 葉期，摩擦接種TZSV，10 min 后用ddH2O 沖洗，每個(gè)辣椒品種接種10 株，3 次重復(fù)。

1.2.2 ID-ELISA 檢測(cè) 以健康的辣椒葉片作為陰性對(duì)照，感病辣椒葉片作為陽(yáng)性對(duì)照，取癥狀明顯的辣椒葉片約0.2 g 研磨成汁液，加入500μL PBS 緩沖液混勻（1m∶30V），取100μL 樣品于酶標(biāo)板上，每個(gè)待測(cè)樣品2 次重復(fù)，37 ℃孵育2 h；用PBST 洗板6 次后，加入200μL 2%牛血清蛋白的PBS 封閉液，37 ℃封閉2 h 或4 ℃過(guò)夜封閉，PBST 洗板6 次，向酶標(biāo)板中加入100μL 效價(jià)1∶8 000 的TZSV 單克隆抗體，37 ℃放置2 h；將酶標(biāo)板拍干，加入100μL 效價(jià)1∶8 000 的羊抗鼠抗體，37 ℃放置2 h；PBST 洗板6 次，將酶標(biāo)板拍 干，加入1 mg·mL-1100μL 顯色液，37 ℃避光放置30 min，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)，吸收波長(zhǎng)為405 nm。

1.2.3 辣椒發(fā)病情況調(diào)查 接種TZSV 5～6 d 后，植株開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，每隔2 d 調(diào)查1 次發(fā)病癥狀及病級(jí)，共調(diào)查3 次（感病植株全部發(fā)病結(jié)束調(diào)查），計(jì)算病情指數(shù)。根據(jù)發(fā)病癥狀和病情指數(shù)進(jìn)行分級(jí)（表2）：免疫（I）（DI=0），高抗（HR）（0 ＜DI ≤10），抗?。≧）（10 ＜DI ≤30），中抗（MR）（30 ＜DI ≤40），感?。⊿）（40 ＜DI ≤50），高感（HS）（DI ＞50）（朱陽(yáng)陽(yáng) 等，2019）。調(diào)查完畢采集辣椒系統(tǒng)葉進(jìn)行ID-ELISA 檢測(cè)。

表2 辣椒TZSV 病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

從圖1 和表3 可以看出，豐達(dá)108、海南黃燈籠椒僅在接種葉產(chǎn)生褪綠、壞死枯斑，植株正常生長(zhǎng)、開(kāi)花結(jié)果（圖1-A、1-B）；豐達(dá)108 發(fā)病率雖為100.0%，但其單株發(fā)病程度較輕，ID-ELISA檢測(cè)值偏低，病情指數(shù)30.00，為抗?。≧）；海南黃燈籠椒的發(fā)病率為50.0%，病情指數(shù)27.78，為抗?。≧）。大果燈籠椒接種葉出現(xiàn)不同程度的白綠相間褪綠斑點(diǎn)、壞死枯斑，系統(tǒng)葉少部分出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，但植株沒(méi)有死亡，新發(fā)的系統(tǒng)葉有隱癥現(xiàn)象，部分隱癥葉片用ELISA 檢測(cè)不到病毒，可以正常開(kāi)花結(jié)果，部分花瓣脫落（圖1-C），發(fā)病率為88.9%，病情指數(shù)49.38，為感?。⊿）。PI-152225、圣鼎1 號(hào)、泰國(guó)燈籠朝天椒、萬(wàn)豪A4F1、赤選牛角王等品種均達(dá)到高感（HS）級(jí)別；接種TZSV 后，植株出現(xiàn)不同程度壞死、矮化，甚至絕收（圖1-D），ID-ELISA 檢測(cè)結(jié)果與病害調(diào)查結(jié)果大致相符。綜上所述，C.annuum中的豐達(dá)108、海南黃燈籠椒、大果燈籠椒具有抗TZSV 的潛力，可應(yīng)用于TZSV 發(fā)病地區(qū)栽培。

表3 ELISA 檢測(cè)法對(duì)辣椒栽培品種TZSV 抗性鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

辣椒病毒病的傳毒介體薊馬分布廣、傳毒率高，加之番茄斑萎病毒屬病毒具有很高的重配和變異率，給病毒病防治帶來(lái)較大難度（Cebollacornejo et al.，2003）。本試驗(yàn)采用摩擦接種的方法對(duì)40 個(gè)辣椒栽培品種進(jìn)行TZSV 抗性鑒定，篩選出抗TZSV 的辣椒品種豐達(dá)108 和海南黃燈籠椒，其余品種均表現(xiàn)為感病和高感，說(shuō)明市場(chǎng)上目前抗TZSV 的品種很少。目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)有關(guān)辣椒栽培品種的TZSV 抗性評(píng)價(jià)，因此，關(guān)于抗TZSV 育種材料的鑒定以及TZSV 的抗性育種研究尤為重要。

相比于甜椒、線椒、朝天椒等品種，小米辣及燈籠椒中可能具有抗TZSV 的辣椒材料。本試驗(yàn)篩選到的豐達(dá)108、海南黃燈籠椒可適當(dāng)在TZSV 發(fā)病地區(qū)推廣種植；大果燈籠椒雖為TZSV 感病品種，但在發(fā)病后仍會(huì)有一定的產(chǎn)量，可在發(fā)病相對(duì)較輕的地區(qū)種植，輔以相應(yīng)的綜合管理措施，從而避免嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；而本試驗(yàn)中絕大部分高感品種，只能在無(wú)病區(qū)種植。今后應(yīng)充分利用這些優(yōu)良種質(zhì)，挖掘其中的抗病基因，選育抗病新品種。本試驗(yàn)篩選的豐達(dá)108、海南黃燈籠椒等品種品質(zhì)相對(duì)優(yōu)良，可作為辣椒TZSV 抗病性改良等基礎(chǔ)研究的親本材料。本試驗(yàn)結(jié)果可為辣椒抗病育種提供可靠的抗病性信息，同時(shí)也可為其他植物的TZSV 抗性鑒定方法提供參考借鑒。