孫 笑 李國亮 李 菲 章時蕃 張 慧 戴 昀 孫日飛 張淑江

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕起源于中國，是種植范圍廣、年消費量最高的十字花科蔬菜之一。隨著消費水平的不斷提高以及蔬菜品種的多樣化，人們對大白菜品質(zhì)的要求越來越高，這對大白菜育種研究提出了更高的要求。

木質(zhì)素（lignin）是由3 種醇單體（對香豆醇、松柏醇、芥子醇）聚合而成的一種復雜酚類聚合物，結構比較穩(wěn)定，它是構成木本植物、草本植物骨架的主要成分之一。其化學成分主要有3種單體類型：由對羥基苯基丙烷結構單體聚合而成的對羥基苯基木質(zhì)素（para-hydroxy-phenyl lignin，H 型），由愈創(chuàng)木基丙烷結構單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（guaiacyl lignin，G 型）和由紫丁香基丙烷結構單體聚合而成的紫丁香基木質(zhì)素（syringyl lignin，S型）（Barros et al.，2015）。木質(zhì)素是植物細胞中由苯丙氨酸/酪氨酸代謝途徑產(chǎn)生的重要的次級代謝產(chǎn)物之一，是世界上第二大生物聚合物，大約占生物圈中有機碳含量的30%（Liu et al.，2018）。木質(zhì)素通過作用于細胞壁來調(diào)控細胞生長發(fā)育，維持植株的機械強度，保證植株物質(zhì)運輸能力，增強抗逆性（Zhao et al.，2020）；同時，其含量增加可顯著提高離子活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、酪氨酸解氨酶（TAL）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性（Lee et al.，2018）。木質(zhì)素是膳食纖維的重要組成部分，相對于纖維素，木質(zhì)素對蔬菜品質(zhì)的影響更大，木質(zhì)素含量增加會導致細胞壁加厚，植物組織木質(zhì)化，進而影響蔬菜產(chǎn)品品質(zhì)（Thimm et al.，2002；Jia et al.，2015）。

目前對植物中木質(zhì)素含量的測定方法已有較廣泛的研究，基本原理主要是基于稱量或光譜學（Fache et al.，2016）：利用木質(zhì)素中的酚羥基發(fā)生乙?；?，通過測定乙酰化木質(zhì)素溶液在280 nm 處的最大紫外吸光值定量判斷木質(zhì)素的含量（Hatfield et al.，1999；Chang et al.，2008；Fukushima et al.，2015；Weijde et al.，2016）；采用72%濃硫酸水解纖維素和半纖維素，稱量不溶于酸的木質(zhì)素的Klason 法（陳為健 等，2002；周強 等，2016）；利用木質(zhì)素能夠溶解于堿液的原理，對木質(zhì)素進行定量測定的堿法（曾漢元 等，2012；Chen et al.，2018）；采用“相似相溶”原理，使木質(zhì)素溶解到有機溶劑中，對木質(zhì)素進行定量測定的溶劑法（黃嬌 等，2009；王東玲 等，2020）；依據(jù)朗伯-比爾定律的紅外光譜定量分析木質(zhì)素含量的近紅外光譜法（Yamada et al.，2006；Tamaki &Mazza，2011；Derkacheva &Tsypkin，2018）等。其中，應用比較廣泛的是利用木質(zhì)素中的酚羥基可以在乙酰溴-冰醋酸溶液中發(fā)生乙?；⑿纬梢阴；举|(zhì)素，且反應體系的紫外吸光值與木質(zhì)素中的酚羥基間存在定量的反應關系，同時在該反應體系中加入高氯酸可促進樣品包括纖維素部分的細胞壁溶解，提高測定的準確度（Hatfield et al.，1999；Chang et al.，2008；Fukushima et al.，2015）。本試驗基于前人的研究結果，利用木質(zhì)素乙?；笤?80 nm 處具有吸收峰值的特性，建立并優(yōu)化了大白菜木質(zhì)素含量的測定方法，以期為大白菜品質(zhì)育種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試大白菜材料共14 份，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所大白菜育種課題組提供，涉及早、中、晚熟類型，能夠保證測定方法的高適用性。2019年8 月26 日定植于本所順義楊鎮(zhèn)試驗基地，大田常規(guī)生產(chǎn)管理，每畦2 行，株行距均為35 cm，每份材料種植30 株。10 月20 日成熟期取樣，測定木質(zhì)素含量。

試驗試劑：木質(zhì)素標準品（純度為90%，北京索萊寶科技有限公司）、乙酰溴（Sigma-Alorich）、高氯酸（天津市風船化學試劑科技有限公司）、冰醋酸（上海麥克林生化科技有限公司），木質(zhì)素測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），所用試劑皆為分析純。

試驗儀器：鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、紫外分光光度計（UV-2500）、電子天平（TB-114）、水浴鍋（上海博訊醫(yī)療設備廠）、干燥柜（HZDs-160011）、Retsch MM400 球型研磨儀〔弗爾德（上海）儀器設備有限公司〕。

1.2 取樣方法

每份材料隨機選取3 個結球緊實的大白菜莖球部（去掉外葉后的功能葉片），采用四分法混樣并人工粉碎，然后取300 g 置于65 ℃烘干箱中烘干至恒重，利用球型研磨儀（25 Hz、10 s）研磨成80 目以上的干粉并編號，置于25 ℃、濕度為10%的干燥柜中保存。

1.3 試驗設計

采用四因素三水平正交試驗設計，按L9（34）正交表（表1）設置9 個處理（表2），比較各因素水平對大白菜木質(zhì)素含量測定結果的影響，每處理3 次重復。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

以大白菜7 號材料為試材，準確稱取5.0 mg置于50 mL 具塞試管中，依次加入乙酰溴濃度為10%～30%的冰醋酸溶液5 mL 和70%高氯酸溶液0.5 mL，蓋好試管塞，在50～70 ℃恒溫水浴下反應15～35 min，每隔10 min 取出振蕩，然后自然冷卻。將反應液移入裝有2 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 mL+冰醋酸溶液10 mL 的容量瓶中終止反應，充分混勻后取1.5 mL，8 000 r·min-1離心5 min。以冰醋酸為空白溶液，取離心后的上清液1 mL，采用1 mL 石英比色皿測定不同反應條件下產(chǎn)物在280 nm 處的紫外吸光值。0～60 min 內(nèi)，每隔20 min 重復測定紫外吸光值。

1.4 正交試驗的驗證及反應條件的優(yōu)化

根據(jù)正交試驗所得最優(yōu)組合進行梯度試驗，對4 個因素進行單因素驗證與優(yōu)化，篩選測定大白菜木質(zhì)素含量的最佳反應條件。乙酰溴濃度梯度設置為0、10%、20%、30%、40%、50%，反應溫度梯度設置為40、50、60、70、80 ℃，反應時間梯度設置為0、10、20、30、40、50、60、70 min。參試材料及測定方法同1.3。

使用木質(zhì)素測定試劑盒對14 份大白菜材料進行木質(zhì)素含量測定，并與優(yōu)化后比色法的測定結果進行差異性分析。

1.5 標準曲線的制作

取木質(zhì)素標準品，配制成濃度分別為0.005 0、0.010 0、0.015 0、0.020 0、0.025 0、0.030 0、0.035 0 mg·mL-1的木質(zhì)素標準液，70 ℃恒溫水浴35 min，每隔10 min 取出振蕩，然后自然冷卻；將反應液移入裝有2 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 mL+冰醋酸溶液10 mL 的容量瓶中終止反應，充分混勻后取1.5 mL，8 000 r·min-1離心5 min，測定280 nm處的紫外吸收值，得到木質(zhì)素標準工作曲線。

1.6 精確度及空白加標回收率

取木質(zhì)素標準品，配制濃度為0.010 0 mg·mL-1的木質(zhì)素標準液，采用優(yōu)化后的比色法連續(xù)測定11 次，計算相對標準偏差（RSD），檢驗該方法的精確度。

取濃度為50 mg·mL-1的木質(zhì)素標準品0.1 mL，以空白溶液為對照，采用優(yōu)化后的比色法平行測定6 次，計算空白加標回收率。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

由表2 可知，A 因素（乙酰溴濃度）各水平間極差最大，其次是B 因素（反應時間）和C 因素（反應溫度），D 因素（體系穩(wěn)定時間）對木質(zhì)素含量測定結果的影響最小；最優(yōu)組合為A3B3C3D1，即乙酰溴濃度為30%，反應時間為35 min，反應溫度為70 ℃，體系穩(wěn)定時間為20 min。

表2 正交試驗設計的因素和水平及極差分析

2.2 乙酰溴濃度的優(yōu)化

乙酰溴的濃度是決定木質(zhì)素乙酰化程度的重要因素。依據(jù)正交試驗結果及王建慶等（2013）的方法，選擇70 ℃、35 min 為反應條件。如圖1 所示，隨著乙酰溴濃度的提高，試樣中木質(zhì)素乙酰化的程度增加，紫外吸光值亦增大，當乙酰溴的濃度超過30%以后紫外吸光值趨于穩(wěn)定，因此判斷30%的乙酰溴濃度下木質(zhì)素乙?；潭茸顬楦咝?。

2.3 反應溫度的優(yōu)化

反應溫度也是木質(zhì)素乙酰化過程中的重要影響因素，高溫會促進木聚糖的分解，導致紫外吸光值增大（Hatfield et al.，1999）；但反應體系溫度超過乙酰溴的沸點（75～77 ℃）會使溶液迸濺，增加試驗的危險系數(shù)；同時還會使乙酰溴與冰醋酸的揮發(fā)量增大，導致乙酰溴-冰醋酸介質(zhì)濃度降低（王建慶 等，2013），進而導致試樣的乙?；潭冉档?，紫外吸光值亦降低。如圖2 所示，選擇30%乙酰溴、35 min 為反應條件，隨著溫度的升高紫外吸光值增加，當溫度超過70 ℃后試樣的紫外吸光值不再產(chǎn)生明顯變化，因此確定70 ℃為最佳反應溫度。

2.4 反應時間的優(yōu)化

選擇30%乙酰溴、70 ℃為反應條件，篩選最佳反應時間。如圖3 所示，0～20 min 反應階段，試樣的紫外吸光值迅速增大，該反應時段木質(zhì)素的溶解率最高；當反應進行到40 min 后，試樣的紫外吸光值趨于穩(wěn)定。結合正交試驗結果，判定40 min 為最佳反應時間。

同時，對反應體系溶液進行穩(wěn)定性檢驗。如圖4 所示，該溶液反應體系較為穩(wěn)定，0～70 min 內(nèi)紫外吸光值無明顯波動。與正交試驗結果一致，該因素對木質(zhì)素含量測定結果的影響最小，在70 min內(nèi)及時測定，試樣的紫外吸光值穩(wěn)定，均可以滿足試驗分析要求。

2.5 兩種方法測定結果比較

分別采用優(yōu)化后的比色法（乙酰溴濃度為30%，反應溫度70 ℃，反應時間40 min）和木質(zhì)素測定試劑盒對14 份大白菜材料的木質(zhì)素含量進行測定，結果如表3 所示，同一試樣采用兩種方法測定的數(shù)值無較大差異。進一步進行差異性分析（表4），F(xiàn)值＜F臨界值，且P值＞0.05，說明這兩種方法所測數(shù)值基本一致，差異不顯著。由此可驗證，優(yōu)化后的比色法準確度較高，符合試驗分析要求。

表3 兩種方法對14 份大白菜材料木質(zhì)素含量的測定結果

表4 差異性分析結果

從表3 還可以看出，采用優(yōu)化后的比色法進行測定，參試14 份大白菜材料木質(zhì)素含量的平均水平為429.27 mg·g-1，變化范圍為207.78～754.18 mg·g-1。說明運用比色法可以準確檢測出不同大白菜材料間木質(zhì)素含量的差異，也反映出比色法靈敏度較高。

2.6 標準工作曲線

按濃度梯度0.005 0、0.010 0、0.015 0、0.020 0、0.025 0、0.030 0、0.035 0 mg·mL-1配制木質(zhì)素標準液，采用優(yōu)化后的比色法測定280 nm 處的紫外吸收值，得到木質(zhì)素標準工作曲線（圖5），其線性方程為y=22.879x-0.002 4，相關系數(shù)R2= 0.994 7。

2.7 精確度及空白加標回收率

配制濃度為0.010 0 mg·mL-1的木質(zhì)素標準液，采用優(yōu)化后的比色法連續(xù)測定11 次，相對標準偏差RSD=0.3%，表明該優(yōu)化方法準確可靠，精確度較高。

取濃度為50 mg·mL-1的木質(zhì)素標準品0.1 mL，以空白溶液為對照，采用優(yōu)化后的比色法平行測定6 次，空白加標回收率在97.3%～101.8%之間（表5），可以滿足試驗分析要求。

表5 空白加標回收率試驗結果

3 結論與討論

本試驗結果表明，在乙酰溴濃度為30%、反應溫度70 ℃、反應時間40 min，加入高氯酸0.5 mL的條件下可以快速、準確測定大白菜中木質(zhì)素的含量。

雖然關于木質(zhì)素含量的測定方法已有較多研究，陳為健等（2002）利用Klason 法對花生殼中的木質(zhì)素含量進行定量分析，黃嬌等（2009）對溶劑法測定木質(zhì)素含量進行了探索，Derkacheva 和Tsypkin（2018）利用光譜法對紙漿中的木質(zhì)素含量進行了定量分析；但是這些測定方法的靈敏度及應用范圍等均有限，Klason 法更適合硬木木質(zhì)素等含量高的樣品測定（李海濤 等，2011），傳統(tǒng)的稱重法預處理步驟繁瑣、試驗過程耗時且誤差大，光譜法、色譜法所需設備要求高、成本高（王君 等，2019）。本試驗所建立的比色法測定大白菜中的木質(zhì)素含量線性范圍大、精密度高、回收率高、簡單快捷，能夠滿足大白菜中木質(zhì)素含量的分析要求，適用于大量樣品的快速檢測，可以更好地為大白菜品質(zhì)育種提供技術支撐。

在建立比色法測定大白菜木質(zhì)素含量的試驗過程中發(fā)現(xiàn)，乙酰溴的沸點為75～77 ℃，試劑盒體系中反應溫度為80 ℃，在高溫加熱時離心管易開蓋而影響吸光值，且有迸濺傷人的風險。本試驗優(yōu)化后的比色法，降低反應溫度至70 ℃，既能滿足試驗要求，又提高了準確度及安全系數(shù)；采用的試驗試劑、設備普通常用；與液相色譜法、核磁共振法、滴定法等相比，操作較為簡單，可批量進行測定，效率高，重復性好，精確度高。此外，乙酰溴為揮發(fā)性藥品，毒性較強，為減少誤差及保證安全需要盡可能操作迅速。

正交試驗極差分析是數(shù)理統(tǒng)計的重要方法，廣泛應用于農(nóng)業(yè)領域，可以簡單、直觀地判斷試驗各因素的主次和變異大小。本試驗通過正交試驗極差分析，確定乙酰溴濃度是影響大白菜木質(zhì)素含量測定的主要因素，其次是反應溫度和反應時間，以此順序進行單因素梯度試驗驗證與優(yōu)化，確定在30%的乙酰溴濃度，70 ℃的反應溫度，40 min 的反應時間條件下，可以簡便、準確地測定大白菜木質(zhì)素含量。

本試驗中，不同類型和表型性狀的大白菜材料木質(zhì)素含量差異較大，其中木質(zhì)素含量最高的9號材料為玉田包尖類型，植株直立緊湊、葉球高樁直筒形，葉紋適中，商品性好，耐貯藏，豐產(chǎn)抗??；含量最低的7 號材料也是玉田包尖類型，但相對矮小且不包心；4、5、6 號材料亦為玉田包尖類型，葉球直筒擰抱、緊實，頂部稍尖、圓錐狀，耐貯藏，不易抽薹，品質(zhì)優(yōu)良，木質(zhì)素含量有一定差異；10、11 號材料為疊抱類型的橘紅心大白菜，12、13、14 號材料為疊抱圓球形或圓柱形早熟大白菜品種，木質(zhì)素含量差異不大且處于參試材料的中等水平；1、2、3 號材料為合抱筒形大白菜，其中1 號材料為中熟品種，株型相對較大，而2、3 號材料為早熟品種，株型相對較小，與之相對應的1 號材料木質(zhì)素含量明顯高于2、3 號材料。由此可見，植株高大、耐貯存、抗病性強的大白菜品種木質(zhì)素含量相對較高，這也與木質(zhì)素在植株中所起的支撐、剛性作用相吻合；植株開展度小、早熟、不結球的大白菜品種木質(zhì)素含量相對較低；品質(zhì)優(yōu)良、株型適中、抗逆性好的疊抱類型大白菜品種木質(zhì)素含量處于兩者中間。今后將進一步擴大檢測群體，探究大白菜木質(zhì)素含量與其表型性狀之間的相關性，以期為大白菜品質(zhì)育種提供技術支撐。