孫亞林 王直新 季 群 劉玉平 黃新芳 朱紅蓮 柯衛(wèi)東

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖北武漢 430207）

芋（Colocasia esculenta）為天南星科芋屬多年生單子葉草本植物。園藝學(xué)上可分為魁芋、多子芋和多頭芋等幾種栽培類型。芋主要食用其地下球莖，糧菜兼宜?？笾杏幸活愐蛴笕猓吹叵虑蚯o可食用部分）纖維顏色呈現(xiàn)出紫色檳榔花紋而被稱作檳榔芋，以品質(zhì)優(yōu)良聞名海內(nèi)外，在我國廣西、廣東、福建、湖南等地區(qū)廣泛栽培（丘培姣和鐘玉芳，2015；董偉清 等，2019）。

檳榔芋一般栽培條件下很少開花，主要依靠球莖無性繁殖。目前生產(chǎn)上檳榔芋一般采用地方品種，品種結(jié)構(gòu)較為單一。近年來，已陸續(xù)開展了芋的赤霉素開花誘導(dǎo)和雜交育種工作（孫亞林 等，2010；劉獨(dú)臣 等，2017），Quero-García 等（2006a）研究表明有性雜交是選育優(yōu)質(zhì)、抗病、高產(chǎn)的芋新品種最有效的方法。目前，SSR、SRAP、SNP 等已廣泛應(yīng)用于蔬菜品質(zhì)性狀的分子標(biāo)記研究中（饒立兵 等，2015；劉哲 等，2016），但關(guān)于芋品質(zhì)性狀的分子標(biāo)記報(bào)道較少。Quero-García 等（2006b）構(gòu)建了芋的第一張遺傳圖譜，找到了與芋產(chǎn)量、球莖直徑相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，同時(shí)鑒定了控制芋肉黃色性狀的基因，認(rèn)為其受1 對顯性基因控制。

芋肉纖維顏色主要有白、黃、棕、紫等（黃新芳和柯衛(wèi)東，2006），其中芋肉纖維呈紫色被認(rèn)為與芋球莖的品質(zhì)緊密相關(guān)，因而最受市場歡迎。Lebot 等（2017）研究表明芋肉紫色纖維中含有10種黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、消炎和保護(hù)神經(jīng)等保健功能。芋肉纖維顏色易識別，且能穩(wěn)定遺傳，在芋遺傳育種中可作為理想的形態(tài)標(biāo)記；但芋生長周期長，該性狀只有在芋球莖成熟收獲后才能進(jìn)行鑒定，費(fèi)力耗時(shí)，因此開發(fā)芋肉纖維顏色性狀的分子標(biāo)記具有重要的育種價(jià)值。

SLAF-seq（specific length amplified fragment sequencing）是一種基于限制性內(nèi)切酶和高通量測序技術(shù)的基因分型策略，通過對特定片段進(jìn)行二代測序獲得海量的、多態(tài)性標(biāo)簽序列來充分代表目標(biāo)物種的全基因組信息（Sun et al.，2013）。該技術(shù)具有步驟簡單、成本低、高通量的優(yōu)點(diǎn)，已在SNP分子標(biāo)記開發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng) 用（Luo et al.，2016；Ye et al.，2016）。目 前，通過SLAF-seq 技術(shù)在芋上開發(fā)特異分子標(biāo)記的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)利用SLAF-seq 技術(shù)獲取了與芋纖維顏色性狀緊密關(guān)聯(lián)的多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽，進(jìn)而開發(fā)出一批特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的SNP標(biāo)記，以期為芋分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2017年1—8 月在武漢市江夏區(qū)國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃露地進(jìn)行，以國家地理標(biāo)志產(chǎn)品荔浦芋（芋肉纖維呈紫色）為母本（P1），樂平野芋（芋肉纖維呈黃色）為父本（P2），通過赤霉素誘導(dǎo)開花雜交得到F1，再由F1自花授粉獲得包含272 個(gè)單株的F2群體。球莖成熟后分別對父母本、F1及每個(gè)F2單株的球莖進(jìn)行縱切，對芋肉纖維顏色進(jìn)行田間鑒定。

1.2 DNA 提取以及混池構(gòu)建

選取母本荔浦芋和父本樂平野芋各5 株，并從F2群體中經(jīng)芋肉纖維顏色鑒定篩選出顏色紫色和黃色植株各40 株。采用CTAB 法提取每個(gè)單株幼嫩葉片的DNA。采用1%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA 的完整性和純度。然后將父本樂平野芋5 株、母本荔浦芋5 株、F2群體中芋肉纖維紫色和黃色極端表型的40 個(gè)單株的DNA 分別等量混合，至終濃度為40ng·μL-1，形成4 個(gè)混池，用于SLAF-seq 建庫測序。

1.3 酶切建庫

利用限制性內(nèi)切酶對檢測合格的4 個(gè)混池的基因組DNA 分別進(jìn)行酶切，對得到的酶切片段（即SLAF 標(biāo)簽）進(jìn)行3′端加A 處理、連接Dualindex 測序接頭（Kozich et al.，2013）、PCR 擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM2500 進(jìn)行上機(jī)測序。因芋尚無參考基因組序列信息發(fā)布，為評估酶切試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，選用水稻品種日本晴（Oryza sativaL.japonica.cv.Nipponbare）為對照進(jìn)行測序（International Rice Genome Sequencing Project，2005）。日本晴基因組大小為374.31 Mb，其序列下載地址為http：//rice.plantbiology.msu.edu。測序由北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.4 SLAF 標(biāo)簽和SNP 標(biāo)記開發(fā)

測序產(chǎn)生的reads 來源于同一限制性內(nèi)切酶對不同樣品作用產(chǎn)生的長度相近的酶切片段，根據(jù)序列相似度將各樣品的reads 進(jìn)行聚類，聚類到一起的reads 來源于一個(gè)SLAF 片段（SLAF 標(biāo)簽）。同一SLAF 標(biāo)簽在不同樣品間的序列相似度遠(yuǎn)高于不同SLAF 標(biāo)簽間的相似度；在不同樣品間序列有差異（即有多態(tài)性）的SLAF 標(biāo)簽，即可定義為多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽。

1.5 關(guān)聯(lián)分析

通過混池間的基因型頻率差異進(jìn)行標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，尋找混池之間基因型頻率的顯著差異，用Δ（SNP index）統(tǒng)計(jì)（Abe et al.，2012）。SNP 與性狀的關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)，Δ（SNP index）越接近于1。由于芋目前尚無參考基因組序列，以0.999 分位點(diǎn)0.9 作為與性狀顯著關(guān)聯(lián)的閾值，大于該閾值的標(biāo)記則為與性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。

1.6 分子標(biāo)記的開發(fā)及穩(wěn)定性檢測

利用Primer Premier 5.0 軟件，針對關(guān)聯(lián)到的SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)AS-PCR（allele specific PCR，等位特異性PCR）引物，引物3′端與模板互補(bǔ)或錯(cuò)配，并在3′端的第2 或第3 位人為引入錯(cuò)配堿基，該錯(cuò)配堿基與3′末端的錯(cuò)配堿基共同作用，減少引物與其3′末端不互補(bǔ)的模板之間的錯(cuò)誤延伸。根據(jù)與芋肉纖維顏色顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)共設(shè)計(jì)42組引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系共25μL，含100ng·μL-1模板DNA1μL、2×Taqmix12.5μL（含Taq酶、dNTP、Mg2+）、10μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、ddH2O9.5μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，45～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳分離群體的構(gòu)建

以芋肉纖維紫色的荔浦芋為母本，芋肉纖維黃色的樂平野芋為父本，雜交獲得F1，然后自交構(gòu)建F2分離群體。在F2群體中芋肉紫色纖維密集程度呈現(xiàn)連續(xù)變化（圖1），表明芋肉纖維顏色為數(shù)量性狀。為了開發(fā)芋肉纖維顏色的分子標(biāo)記，在F2群體中篩選芋肉纖維紫色和黃色材料各40 份，用于BSA（bulked segregant analysis）分析。

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評估

用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅴ和ScaⅠ對芋基因組進(jìn)行酶切，酶切片段長度在364～464 bp 的序列定義為SLAF 標(biāo)簽。為保證分析質(zhì)量，采用100 bp 雙端測序進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)評估和分析。通過對水稻日本晴測序數(shù)據(jù)的評估監(jiān)控試驗(yàn)過程是否正常，確定酶切方案實(shí)施的有效性。

利用Illumina HiSeqTM2500 平臺進(jìn)行測序，共獲得37.65 Mb reads 數(shù)據(jù)，對各樣品的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評估（表1）。測序后各樣品所獲的reads 數(shù)目在3 909 833～13 575 917 范圍內(nèi)，測序質(zhì)量值Q30為94.41%～95.21%，均在90%以上，說明測序堿基錯(cuò)誤率低，所獲數(shù)據(jù)合格。測序獲得GC 含量的范圍在39.59%～40.28%。

表1 各樣本測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 SNP 位點(diǎn)開發(fā)及關(guān)聯(lián)分析

SLAF 標(biāo)簽親本平均深度為44.43×，混池平均深度為57.62×。其中父本的測序深度為55.78×，母本的測序深度為33.09×，aa 池的測序深度為54.01×，ab/bb 池的測序深度為61.22×（表2），累計(jì)開發(fā)了293 363 個(gè)SLAF 標(biāo)簽。采用GATK 軟件檢測SNP 位點(diǎn)，共得到134 372 個(gè)SNP，其中芋肉纖維紫色的母本得到107 190 個(gè)SNP，芋肉纖維黃色的父本得到124 912 個(gè)SNP，芋肉纖維紫色混池得到128 317 個(gè)SNP，芋肉纖維黃色混池得到130 247 個(gè)SNP。SNP 雜合率為19.31%～70.86%。

表2 SLAF 標(biāo)簽和SNP 位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

在SNP-index 關(guān)聯(lián)分析前，需要先對134 372個(gè)SNP 進(jìn)行過濾，過濾掉有多重突變的SNP 位點(diǎn)共358 個(gè)，再過濾掉混池中read 支持度小于4 的位點(diǎn)38 642 個(gè)，再過濾掉混池中基因型一致的位點(diǎn)共12 239 個(gè)，再過濾掉親本中不存在的SNP 位點(diǎn)共25 423個(gè)，最終獲得57 710個(gè)SNP用于后續(xù)分析。

采用SNP-index 方法計(jì)算關(guān)聯(lián)值，以0.999 分位點(diǎn)0.9 作為閾值，篩選出與性狀關(guān)聯(lián)程度較顯著的27 個(gè)SNP 位點(diǎn)（表3）。

表3 與芋肉纖維顏色性狀連鎖的SNP 標(biāo)記

2.4 芋肉纖維顏色相關(guān)連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)關(guān)聯(lián)分析獲得的SNP 標(biāo)記，共設(shè)計(jì)42組引物開展篩選。通過對纖維紫色、黃色和雙親的基因組DNA 模板進(jìn)行AS-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明，Marker44764（引物序列Marker44764-F：5′-GCTATTCAGTTCTATGTTGATTACC-3′，Marker44764-R：5′-CATCACACCAGGACCTCTA C-3′）能較好地區(qū)分芋肉纖維顏色性狀，在母本和F2中芋肉纖維紫色的單株中均能擴(kuò)增出245 bp 的特異條帶，父本和F2中18 個(gè)芋肉纖維黃色的單株均不能擴(kuò)增出特異條帶，僅有2 個(gè)芋肉纖維黃色的F2單株擴(kuò)增出了條帶，該標(biāo)記在F2分離群體中的檢出率達(dá)到95%（圖2），表明該標(biāo)記與芋肉纖維顏色性狀緊密連鎖，可用于芋雜交后代的苗期分子標(biāo)記輔助選擇。

3 討論

3.1 SLAF-seq 測序技術(shù)應(yīng)用

SLAF-seq 技術(shù)是對傳統(tǒng)BSA 方法的升級，可在全基因組水平進(jìn)行SNP 掃描，相比SSR、AFLP、RAPD 等傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)，無論從標(biāo)記數(shù)量，還是穩(wěn)定性等方面，SLAF-seq 技術(shù)都具有無可比擬的優(yōu)勢。該技術(shù)同時(shí)適用于沒有參考基因組的作物，能有效克服基因組復(fù)雜、序列與標(biāo)記信息缺乏等問題，可在較短時(shí)間內(nèi)完成較高深度的簡化基因組測序和大規(guī)模SNP 標(biāo)記開發(fā)。目前，SLAFseq 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥、大豆、油菜、甜瓜等多種作物（張紅 等，2015；Xia et al.，2015；Geng et al.，2016；Yin et al.，2018），并取得了顯著的效果。如杜龍崗和王美興（2018）通過SLAF-seq 技術(shù)對玉米果皮纖維素含量進(jìn)行研究，對親本和重組自交系群體的極端單株混池進(jìn)行SLAF 測序，共獲得73 786 個(gè)SLAF 多態(tài)性標(biāo)簽，檢測到523 395 個(gè)SNP 位點(diǎn)，獲得6 個(gè)控制玉米果皮纖維素含量的染色體區(qū)段，并確定了9 個(gè)候選基因。

目前，芋參考基因組序列尚未公布，利用常規(guī)方法開發(fā)與芋特定性狀連鎖的分子標(biāo)記耗時(shí)長、難度大。本試驗(yàn)通過SLAF-seq 技術(shù)，共獲得37.65 Mb 的reads 數(shù)據(jù)，從293 363 個(gè)SLAF 標(biāo)簽上開發(fā)獲得57 710 個(gè)高質(zhì)量的SNP 位點(diǎn)，從中篩選到27個(gè)與芋肉纖維顏色性狀緊密關(guān)聯(lián)的差異標(biāo)記。

3.2 關(guān)于芋肉纖維顏色性狀的分子標(biāo)記輔助選擇

Ivancic 等（2003）對702 份芋雜交后代各性狀進(jìn)行調(diào)查，并進(jìn)行表型性狀關(guān)聯(lián)分析，相關(guān)性分析結(jié)果表明，芋肉顏色和芋肉纖維顏色可以通過對葉柄基部的顏色和葉柄下部（基部上方2～3 mm）的顏色進(jìn)行評分來確定，可以在植株生長前期完成，加快循環(huán)選擇過程。但該方法也存在局限性，如果親本基因型改變，雜交后代的評分模型可能會發(fā)生改變，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。通過分子標(biāo)記輔助篩選可以克服這個(gè)問題，首先，分子標(biāo)記不受環(huán)境、親本基因型的影響；其次，選擇效率更高，分子標(biāo)記輔助選擇可以在苗期進(jìn)行，可在早期對目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選，省時(shí)省力。分子標(biāo)記輔助選擇可極大提高選擇的效率，加速作物的遺傳改良（Collard &Mackill，2008）。本試驗(yàn)是國內(nèi)進(jìn)行芋品質(zhì)性狀分子標(biāo)記開發(fā)的首次嘗試。利用SLAF-seq 技術(shù)篩選出與芋肉纖維顏色性狀緊密關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)27個(gè)，通過AS-PCR 技術(shù)進(jìn)行SNP 位點(diǎn)多態(tài)性驗(yàn)證，獲得了1 組引物，具有良好基因分型效果。分子標(biāo)記與之前的形態(tài)標(biāo)記相比，特異性、靈敏度、穩(wěn)定性均顯著提高。通過對40 個(gè)單株進(jìn)行檢測驗(yàn)證，結(jié)合田間鑒定結(jié)果，其準(zhǔn)確率達(dá)到95%，能極大地提高育種選擇效率。

4 結(jié)論

通過SLAF-seq 技術(shù)測序獲得芋37.65 Mb 的數(shù)據(jù)，基于293 363 個(gè)SLAF 標(biāo)簽，開發(fā)了57 710個(gè)高質(zhì)量的SNP 位點(diǎn)。篩選到27 個(gè)與芋肉纖維顏色性狀緊密關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)。通過AS-PCR 技術(shù)進(jìn)行SNP 位點(diǎn)多態(tài)性驗(yàn)證，其中Marker44764 操作簡單、穩(wěn)定性好，能有效實(shí)現(xiàn)芋肉纖維顏色早期基因分型，可對芋育種材料進(jìn)行苗期的分子標(biāo)記輔助選擇，提高芋雜交育種的單株選擇效率。