練冬梅 賴正鋒 姚運(yùn)法 洪建基

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州 363005）

土壤鹽漬化是影響植物生長(zhǎng)和威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一，也是一個(gè)在世界范圍內(nèi)不斷蔓延的問題（Campbell et al.，2015；Ozfidan-Konakci et al.，2015）。鹽漬化土壤中高濃度的NaCl 在不同生理水平上影響植物生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株水分缺失、離子毒性、營養(yǎng)失衡和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，引起蛋白質(zhì)和核酸損傷，生長(zhǎng)和產(chǎn)量下降，甚至導(dǎo)致植株死亡（Xiong et al.，2017）。植物已經(jīng)進(jìn)化出對(duì)不同程度鹽脅迫的耐受性，例如，在鹽脅迫下植物通過積累可溶性滲透保護(hù)物質(zhì)如脯氨酸、多醇甜菜堿和可溶性糖進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)（Sun et al.，2017）。

黃秋葵（Abelmoschus esculentusL.）為錦葵科一年生或多年生特色保健蔬菜，主要分布于熱帶亞熱帶地區(qū)，具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、割莖再生能力強(qiáng)（劉勇 等，2015）、抗逆性較強(qiáng)（Chandra et al.，2016）等特點(diǎn)，適宜在輕、中度鹽堿區(qū)種植，因此黃秋葵在我國沿海地區(qū)種植面積較大（劉雅輝 等，2017）。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究了鹽脅迫對(duì)黃秋葵生態(tài)特征、生理生化的影響（王永慧 等，2015，2016；Jeyapraba et al.，2016；劉雅輝 等，2017；王繼玥 等，2017；Azeem et al.，2017；Guealia et al.，2017），還進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析（Yu et al.，2019；Zhan et al.，2019），但對(duì)鹽脅迫下黃秋葵幼苗轉(zhuǎn)錄組分析鮮見報(bào)道。在高等植物鹽脅迫研究中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于冰菜（練冬梅 等，2019）、偃麥草（盧銳和李培英，2020）、長(zhǎng)豇豆（Pan et al.，2019）等植物中。前人研究表明，鹽對(duì)植物地上部生長(zhǎng)的抑制作用大于地下部（朱義 等，2007；谷艷芳 等，2009）。本試驗(yàn)以福建漳州沿海地區(qū)常年種植的黃秋葵品種助農(nóng)2 號(hào)為試驗(yàn)材料，對(duì)400 mmol·L-1NaCl脅迫24 h后的黃秋葵地上部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以期獲得與耐鹽性狀相關(guān)的調(diào)控基因，為黃秋葵耐鹽基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年5 月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所進(jìn)行。黃秋葵（AbelmoschusesculentusL.）品種助農(nóng)2 號(hào)的種子購于福建漳州種子商店。

1.2 鹽脅迫處理

黃秋葵種子經(jīng)10%次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3 次，置于恒溫箱中催芽。種子露白后播于裝有泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=3V∶1V∶1V干凈基質(zhì)的7 cm × 7 cm × 10 cm（長(zhǎng)×寬×高）花盆中，共播種6 盆，每盆播1 粒，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，發(fā)芽7 d 后開始每2 d 澆1 次1/2 Hoagland營養(yǎng)液，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，選擇生長(zhǎng)一致的幼苗用400 mmol·L-1NaCl 進(jìn)行脅迫處理24 h，對(duì)照用清水處理24 h。

1.3 采樣

分別取鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后的黃秋葵幼苗地上部分，各3 次重復(fù)。鹽脅迫處理的3 次生物學(xué)重復(fù)分別記為T01、T02、T03；對(duì)照的3 次生物學(xué)重復(fù)分別記為T04、T05、T06。迅速放入液氮速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析

采用RNAprep Pure Plant Kit 試劑盒提取黃秋葵幼苗地上部分總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100 技術(shù)檢測(cè)RNA 樣品的純度、濃度和完整性，構(gòu)建cDNA 文庫，再使用Q-PCR方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，用Illumina HiSeq TM2500 進(jìn)行高通量測(cè)序。運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)和方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行前期處理、序列比對(duì)、基因及基因組的注釋、基因表達(dá)分析等。按照FPKM 法計(jì)算差異基因的表達(dá)量，若log2Fold change ＞0，則上調(diào)表達(dá)，反之，下調(diào)表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)組裝和分析

鹽脅迫處理和對(duì)照的黃秋葵幼苗經(jīng)高通量測(cè)序和質(zhì)量控制，共獲得70.17 Gb 有效數(shù)據(jù)（Clean data），Q30 堿基百分比均在93.21%以上（表1），表明測(cè)序結(jié)果可靠，可用于后續(xù)的分析。對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2），共產(chǎn)生60 177 條單基因序列（Unigene）和342 407 條轉(zhuǎn)錄本序列（transcipt），N50 分別為1 569 bp 和1 870 bp，組裝完整性較高；其中長(zhǎng)度為300～500 bp 的單基因序列數(shù)量最多，為24 506 條，占40.72%，且隨著長(zhǎng)度的增加，單基因序列的數(shù)目減少。

表1 有效數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)

表2 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 單基因序列功能注釋

為獲得Unigene 的功能注釋信息，通過COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG 和NR 等8 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋分析（表3），在60 177 條Unigene 中，共獲得38 087 條（63.29%）注釋，以上8 個(gè)數(shù)據(jù)庫分別獲得9 879（16.42%）、22 205（36.90%）、14 417（23.96%）、20 320（33.77%）、23 009（38.24%）、25 661（42.64%）、34 294（56.99%）、37 176 條（61.78%）注釋。

表3 單基因序列的功能注釋

2.3 差異表達(dá)基因分析

通過對(duì)黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h后地上部分差異基因的表達(dá)分析，共獲得1396個(gè)差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），包括588 個(gè)上調(diào)基因，808 個(gè)下調(diào)基因，將其DEGs 單基因序列分別在8 個(gè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋，共獲得1 266 個(gè)基因功能注釋，COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG 和NR數(shù)據(jù)庫分別注釋405、743、421、581、918、994、1 197 個(gè)和1 263 個(gè)，其中以NR 數(shù)據(jù)庫注釋比率最高，達(dá)99.76%。

2.3.1 差異表達(dá)基因的GO 功能注釋 黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后地上部分差異基因GO功能注釋的743 個(gè)DEGs 共分為3 大類，分別為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能，又劃分為43 個(gè)功能小類（圖1），生物過程的DEGs 以代謝過程（43.1%）、細(xì)胞過程（35.5%）和單一生物過程（30.6%）3 個(gè)功能小類的數(shù)量最多；細(xì)胞組分的DEGs 以內(nèi)膜（43.2%）、內(nèi)膜組分（36.5%）、細(xì)胞（33.5%）、細(xì)胞組分（33.0%）和細(xì)胞器（21.1%）5 個(gè)功能小類的數(shù)量最多；分子功能的DEGs 以催化活性（49.7%）和結(jié)合活性（46.4%）2 個(gè)功能小類的數(shù)量最多。以上注釋較多的過程涉及到的基因可能參與了黃秋葵鹽脅迫響應(yīng)過程，進(jìn)一步挖掘這些差異表達(dá)基因有助于研究其抗逆機(jī)制。

2.3.2 差異表達(dá)基因的KOG 功能注釋 對(duì)黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后地上部分差異基因KOG 數(shù)據(jù)庫注釋的581 個(gè)DEGs 進(jìn)行直系同源分類，獲得24 個(gè)功能分類（圖2），主要集中在一般性功能預(yù)測(cè)（23.1%）。植物生長(zhǎng)發(fā)育過程有大量基因表達(dá)，在鹽脅迫下，部分涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（13.3%），以及次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝（11.9%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶（10.5%）等過程，說明這些生物學(xué)過程對(duì)于黃秋葵生命活動(dòng)的重要性。

2.3.3 差異表達(dá)基因的KEGG 功能注釋 KEGG分析可以從功能的角度聚焦到通路及基因，也可以從基因的角度鎖定功能和互作關(guān)系，直觀地顯示黃秋葵在鹽脅迫下差異表達(dá)基因的代謝過程和信號(hào)通路，有助于更好地研究黃秋葵響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制。由表4 可知，黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后地上部分差異基因分別富集在421 個(gè)KEGG代謝通路，主要分為5 類：第1 類為細(xì)胞過程，涉及到1 個(gè)通路，為內(nèi)吞作用；第2 類為環(huán)境信息處理，共有2 個(gè)通路，分別為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；第3 類為遺傳信息處理，涉及到5 個(gè)通路，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工最多；第4 類為新陳代謝，共有40 個(gè)通路，最多的為淀粉和蔗糖代謝（8.9%），其次為苯丙素的生物合成（6.7%）；第5類為有機(jī)系統(tǒng)，共有2 個(gè)通路，分別為植物病原菌互作和晝夜節(jié)律-植物。這說明鹽脅迫下黃秋葵幼苗的各種代謝途徑都發(fā)生了變化。

表4 差異表達(dá)基因KEGG 功能注釋

2.4 關(guān)鍵基因差異分析

通過對(duì)黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后地上部分轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能注釋、功能分類及代謝途徑分析表明（表5），過氧化物酶55 基因、超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因、4-羥基肉桂酸基因、黃酮醇合成酶基因、查爾酮合成酶基因上調(diào)表達(dá)，主要參與植物體內(nèi)抗氧化及活性氧清除過程；WRKY21 轉(zhuǎn)錄因子基因、ERF2 轉(zhuǎn)錄因子基因、NAC29 轉(zhuǎn)錄因子基因、GATA22 轉(zhuǎn)錄因子基因、MYB4 轉(zhuǎn)錄因子基因、生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因上調(diào)表達(dá)，主要參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程；海藻糖-磷酸酶基因、磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶1 基因上調(diào)表達(dá)，主要參與植物滲透調(diào)節(jié)過程。

表5 鹽脅迫下黃秋葵幼苗差異基因的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

土壤鹽分是限制植物生長(zhǎng)的主要非生物脅迫之一，研究植物耐鹽機(jī)制將有助于改進(jìn)植物耐鹽性。黃秋葵具有復(fù)雜的異源多倍體基因組（2n=130～140），近年來，人們開始關(guān)注黃秋葵種質(zhì)的遺傳改良（Zhang et al.，2018）。本試驗(yàn)利用Illumina HiSeq TM2500 高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后地上部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，借助其他物種數(shù)據(jù)庫的已有信息，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行比對(duì)分析，表明鹽脅迫后黃秋葵幼苗地上部分的植物活性氧清除、植物生長(zhǎng)發(fā)育及植物滲透調(diào)節(jié)相關(guān)功能蛋白基因的表達(dá)發(fā)生了改變。

鹽脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）積累，過量的ROS 氧化植物細(xì)胞，對(duì)植物造成不可逆的傷害（Sekmen et al.，2014）。植物可能通過合成大量的ROS 清除相關(guān)的酶類和其他次生代謝物質(zhì)，來降低植物受到的氧化損傷。研究表明，過氧化物酶體、黃酮、谷胱甘肽等抗氧化劑在植物體內(nèi)具有抗氧化和ROS 清除能力（孫靜，2006；Watkins et al.，2014；Silva et al.，2016）。鹽脅迫下，黃秋葵幼苗中過氧化物酶55 基因、超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因、4-羥基肉桂酸基因、黃酮醇合成酶基因、查爾酮合成酶基因上調(diào)表達(dá)，有利于合成過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和黃酮，促進(jìn)黃秋葵體內(nèi)ROS 清除，提高黃秋葵的鹽脅迫耐受性。

植物中各類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境中起到主要作用（趙航 等，2014）。屈興紅和曾洪學(xué)（2019）研究發(fā)現(xiàn)，金冕草受到鹽脅迫后會(huì)引起MYB 和WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的強(qiáng)烈表達(dá)。田林等（2020）研究表明，比拉底白刺通過WRKY、ERF、NAC、GATA 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控來增加耐鹽性。本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對(duì)照24 h 后WRKY21 轉(zhuǎn)錄因子基因、MYB4 轉(zhuǎn)錄因子基因、ERF2 轉(zhuǎn)錄因子基因、NAC29 轉(zhuǎn)錄因子基因、GATA22 轉(zhuǎn)錄因子基因均上調(diào)表達(dá)，有利于增強(qiáng)黃秋葵幼苗耐鹽性，與前人研究結(jié)果一致。植物激素在鹽脅迫下植物生長(zhǎng)發(fā)育中也起到重要作用（練冬梅 等，2019）。本試驗(yàn)中，生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，加速細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，提高黃秋葵的鹽脅迫耐受性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子需要進(jìn)一步挖掘其功能，以期探究黃秋葵的耐鹽機(jī)理。

鹽脅迫下，植物通過自身合成小分子有機(jī)溶質(zhì)（糖類、甜菜堿、醇類等）維持細(xì)胞滲透勢(shì)，從而減少鹽脅迫損傷（黎裕，1994）。在本試驗(yàn)的關(guān)鍵差異表達(dá)基因中，海藻糖-磷酸酶基因、磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶1 基因上調(diào)表達(dá)，分別有利于合成海藻糖和甜菜堿，以提高細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)，從而提高黃秋葵的鹽脅迫耐受性。

植物是通過一系列基因相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)耐鹽性的（Zhou et al.，2013）。黃秋葵經(jīng)400 mmol·L-1鹽脅迫后，在一系列關(guān)鍵基因共同作用下進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育，抵抗鹽脅迫的危害。本試驗(yàn)中所篩選的抗氧化及活性氧清除相關(guān)基因、植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因和滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因均為上調(diào)基因，證明黃秋葵能夠通過增強(qiáng)活性氧清除、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和滲透調(diào)節(jié)來提高鹽脅迫適應(yīng)能力。本試驗(yàn)從分子水平上研究了對(duì)應(yīng)的耐鹽基因及其差異表達(dá)，為篩選黃秋葵耐鹽關(guān)鍵基因和功能驗(yàn)證提供重要的分子基礎(chǔ)，同時(shí)為改善土壤鹽漬化具有重要意義。