劉文凱，王家敏，喬自林，郭鵬輝，王明明

(1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學工程學院，甘肅 蘭州730030)

天然產(chǎn)物在新藥研發(fā)過程中起著舉足輕重的作用，而土壤是其開發(fā)的主要來源.駐留在植物組織內(nèi)的微生物，稱為內(nèi)生菌，而放線菌產(chǎn)生天然產(chǎn)物的比重較大.目前發(fā)現(xiàn)的放線菌雖然有20 000多種，但對于避免重復檢測卻變得越來越困難，還耗費時間、資源.因此研究者就從植物中分離放線菌及次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤物質(zhì)、保護激素、生長激素等.近年來，從放線菌次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了很多具有商業(yè)價值的活性物質(zhì)，但無較大研發(fā)進展，原因是放線菌傳統(tǒng)篩選方法效率低.為了提高生產(chǎn)效率，需將基因工程、代謝工程等運用到放線菌的生產(chǎn)中.本文就植物內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物的功能及生產(chǎn)效率加以綜述，以期為研究和生產(chǎn)有益菌提供參考.

1 植物內(nèi)生放線菌代謝產(chǎn)物生物學活性

微生物是抗生素的主要來源，而耐藥性卻是影響藥物的主要因素，也是影響人類公共衛(wèi)生和動物健康的一個主要問題.人類對抗生素的生產(chǎn)和使用促進了耐藥病原菌的產(chǎn)生，而只有1%～3%的天然產(chǎn)物抗菌劑是已知的.為解決天然的未知的抗菌劑，人們在不斷探求尋找新的抗生素類化合物.

1.1 抑菌作用

作為天然抗生素最主要的來源，無論是人類病原菌還是植物病原菌、植物內(nèi)生放線菌均展現(xiàn)出杰出的抗菌活性.Long H從Solawam sp.根中分離到73個內(nèi)生菌株對被測植物致病菌有廣泛的抑制作用，對革蘭氏陽性致病性菌的抑制作用最強.這些菌株具有抑制各種致病性細菌生長的能力，是潛在的生物防治劑[1].Solecka J等也從植物中發(fā)現(xiàn)的398株放線菌，10%～20%的代謝產(chǎn)物對原蟲有少量抗性[2].放線菌產(chǎn)生的抗菌劑具有對病原菌的毒害作用，卻對人體無害等特點.有研究者用紙片法探究了植物發(fā)酵液樣品產(chǎn)生抑菌和抗真菌化合物的能力.研究表明，放線菌可通過產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物來控制病原性入侵的抗性機制.從柑橘果實中分離到的TQR12-4菌株具有抑菌活性，對試驗病原菌、白地霉菌、尖孢鐮刀菌和鐮刀菌均有抑制作用.2019年從同地區(qū)藥用植物中提取的放線菌，培養(yǎng)出的LGMB471對枸櫞酸有明顯的抑制作用，且只對柑橘果實具有顯著的抗菌活性[3].表 1提供了近10年來植物內(nèi)生放線菌的抑菌活性，以供研究者參考.

表1 2010—2020年間植物內(nèi)生放線菌抑菌性研究情況

1.2 抗瘧疾作用

瘧疾是公共衛(wèi)生全球性的一項巨大挑戰(zhàn)，每年報告的新感染病例和死亡人數(shù)達百萬.由于寄生蟲對已有的抗瘧疾藥物會產(chǎn)生耐藥性，這就使得瘧疾的傳播不能及時阻斷.Baba M.S分離的提取物(SUK8、SUK10和SUK27)具有抗瘧疾活性.他從卵圓索樹樹皮中得到的鏈霉菌(Streptomyces SUK10)對試驗菌有抑制作用，并對感染貝爾赫瘧原蟲的小鼠進行了抗瘧試驗.鏈霉菌的核苷酸序列和系統(tǒng)發(fā)育樹表明，SUK10可能是鏈霉菌屬中的一個新種[4].Streptomyces hygroscopicus Hygroscopicus是放線菌家族中的一員，F(xiàn)itri L E將小鼠分為1個對照組(白芍感染后不治療組)和3個治療組(白芍感染后腹腔內(nèi)給藥)，從第一天的瘧疾誘導到最后一次誘導與治療進行測量.結(jié)果表明，代謝物中的伊潘霉素可抑制其UPS功能，引起應激和死亡，是潛在的新型瘧疾藥物[5].

1.3 保護作用

內(nèi)生放線菌代謝產(chǎn)物能有效抑制植物病原菌，從而保護寄主植物免受病菌的侵襲.Tena A R從叢枝菌根真菌(AMF)對辣椒植物生長和枯萎病的抑制作用進行了研究.她在溫室條件下進行盆栽試驗，并對Cerro del Metate菌根結(jié)合物和ABV 39和ABV 02放線菌進行了鑒定.結(jié)果表明，AMF與放線菌共接種在辣椒植株上能夠促進植物生長并具有抵抗枯萎病的協(xié)同作用[6].在一項涉及260株內(nèi)生放線菌的研究中，發(fā)現(xiàn)80%的可抑制植物病原體.Kaur T從旁遮普邦和喜馬恰爾邦的不同植物中分離出321株菌株.在初步篩選(雙培養(yǎng)法)中，83株菌株拮抗一種或多種植物病原真菌.對植物生長促進活性的研究表明，12株具有產(chǎn)生吲哚乙酸的能力，10株產(chǎn)生鐵磷，12株具有產(chǎn)氨能力.這些菌株可作為生物防治和植物生長促進劑[7].Haque M A從大白菜品種(SS、HN、TP)葉片中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌群落，分離出的(TPL 08)和枯草芽孢桿菌(SSL 16，HNL 10)可通過抑制病原菌對大白菜幼苗的感染起到保護作用[8].

1.4 抗腫瘤作用

根據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，癌癥是全球危害人類健康且導致死亡的十大主要原因之一.因人體對化療藥物耐藥性的不斷增強，且化療藥物具有毒性和副作用，所以尋找新型藥物減少化療的不良反應是癌癥治療的優(yōu)先目標.20世紀40年代至2006年間批準的175種抗癌藥物中，42%是天然產(chǎn)物或由其衍生的化合物[9].1993年Stierle等第一次從短葉紫杉的樹皮中提取紫杉類化合物.這一發(fā)現(xiàn)為利用紫杉醇生產(chǎn)藥物提供了途徑，從而掀起了放線菌抗腫瘤研究的熱潮.Caruso等從紅豆杉植株中提取抗腫瘤物質(zhì)，得出紅豆杉烷類物質(zhì)的合成途徑，但其調(diào)控機制尚待研究.Xiao J從福建漳州紅樹林沉積物中分離出163株放線菌，并用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和3株腫瘤細胞(BEL 7402、A 549和HL 60)對分離菌株的抗微生物活性和抗腫瘤活性進行了檢測.研究發(fā)現(xiàn)，42.3%的放線菌發(fā)酵液具有抗菌活性，37.4%的放線菌發(fā)酵液具有抗腫瘤活性[10].Vochysia divergens是一種常見于潘塔納爾地區(qū)的巴西藥用植物.Haminiuk C從Vochysia divergens中分離出的兩個菌株能夠產(chǎn)生具有抗氧化活性的次級代謝產(chǎn)物，對成釉瘤細胞具有抵抗活性[11].

1.5 促生長作用

放線菌具有產(chǎn)生多種高價值抗生素、有機酸、植物激素、胞外酶和生物活性化合物的次生代謝物的能力.多種放線菌能直接促進植物生長，保護植物免受植物病原和害蟲的侵害.Liotti R G從泡菜中分離出11種內(nèi)生放線菌，可促進辣椒植株生長，能使莖的質(zhì)量增加42%.紅鏈霉菌R132是辣椒采前和收獲后促進生長和病原生物防治的有效工具[12].El-Tarabily K A在溫室條件下測試了29種內(nèi)生菌.當單獨或組合使用時，它們能夠顯著地促進植物的生長，還可減少黃瓜的根冠與根腐病.與單獨暴露在單個菌株的情況相比，三種分離株的組合可顯著地抑制疾病和促進植物生長[13].Long H H從甘蔗植物中分離出83種內(nèi)生放線菌，均具有促進植物生長的特性，包括吲哚-3-乙酸(IAA)和鐵載體的產(chǎn)生、磷的增溶和對植物病原真菌的拮抗作用[14].Jog等人從小麥內(nèi)生菌中分泌的植酸酶以及磷活性物質(zhì)可顯著改善植物的生長狀態(tài).除了磷，植物也可依靠磷鐵復合物的形式提高鐵的利用率.小麥放線菌代謝產(chǎn)物可顯著提高植株生長量和礦物質(zhì)(Fe、Mn、P)的含量.

2 放線菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量研究

突變和重組的研究對于提高放線菌次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量仍然有效，分子遺傳學方法可減少步驟，并提供基因調(diào)控和次級代謝物生物合成.這些信息可用于指導菌株改良策略，并將隨機誘變、選擇和重組與分子克隆相結(jié)合，以優(yōu)化產(chǎn)品產(chǎn)量.在長期生產(chǎn)實踐中，逐漸積累了提高放線菌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，主要有基因工程技術(shù)優(yōu)化、維生素優(yōu)化及發(fā)酵工藝優(yōu)化等.

2.1 基因工程技術(shù)優(yōu)化

20世紀70年代興起了基因工程技術(shù)，而現(xiàn)階段在分子水平上逐步對微生物進行改造，并通過基因重組來提高產(chǎn)量.其原理主要為改良分子遺傳方法(見圖1).FK 520(Ascomycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯，具有免疫抑制活性.Yu Z使得丙二酰輔酶的乙酰輔酶(ACCase)在SFK-6-33中的過表達，使FK 520的產(chǎn)率提高到3 320.1 mg/L，但對FK 523的合成沒有明顯的抑制作用.為進一步提高FK 520的產(chǎn)量，構(gòu)建了FkbS和ACCase的過表達組合菌株SFK-OASN.FK 520產(chǎn)量比SFK-6-33提高了44.4%，達到3 511.4 mg/L.這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)誘變結(jié)合代謝工程是提高FK 520產(chǎn)量的有效策略.Tn5099和Tn5096為編碼外向閱讀啟動子活性元素.這些反式子能夠激活鄰近插入位點的基因轉(zhuǎn)錄.對S.roseosporus中的插入研究表明，某些突變體過量會產(chǎn)生紅色素(一種次級代謝產(chǎn)物)，另一些突變體過量會產(chǎn)生脂肽抗生素如達托霉素，而有些情況還會使兩者都產(chǎn)生.這種次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的增加可能是因便攜式啟動子的活性或負調(diào)控元件的失活而發(fā)生.Tn5099可以與側(cè)翼的DNA一起克隆到大腸桿菌中增加產(chǎn)量.而Tn5096和Tn5099都具有廣泛的宿主范圍，可通過接合或轉(zhuǎn)導在大腸桿菌的載體上引入鏈霉菌[15].紅霉素產(chǎn)量的提高一直受到基因工程方法的限制.Benjamin Kirm利用蛋白組學方法篩選了參與紅霉素生物合成的調(diào)節(jié)蛋白.有學者已鑒定出一種調(diào)節(jié)蛋白SCE-5599.鑒定出的這種合成蛋白與野生型相比，該蛋白在紅霉素高產(chǎn)菌株中的表達水平顯著提高.除此之外，SACE-5599對紅霉素產(chǎn)率有積極影響，BldD和SACE-5599參與了次生代謝產(chǎn)物的生物合成.雖然SACE-5599的作用機制尚未闡明，但已顯示出具有提高紅霉素生產(chǎn)的潛力[16].

圖1 菌株改良的分子遺傳方法

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3 維生素優(yōu)化

就抗生素產(chǎn)量提高而言，目前常采用的方法是優(yōu)化發(fā)酵工藝，但也可通過添加維生素提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量.IStreptomyces/I是革蘭氏陽性細菌，對許多抗生素和次生代謝物的生產(chǎn)具有重要意義.脫鐵胺(亦稱去鐵胺B、DFO-B、DFOA、DFB或Desferal)是由多種放線菌產(chǎn)生和分泌的低分子量鐵螯合物，包括IStreptomyces/I、Incartomyces/I和IMicromonospora/I.IStreptomyces pilosus/I合成的鐵螯合物B，臨床上用于治療與鐵超載和病理鐵沉積有關的疾病.Vijayakumar R將大豆作為添加劑，如NaSUB 2/SUBHPOSUB 4/SUB.12HSUB2/Subo，NaHSUB 2/SUBPOSUB 4/SUB 4等，氨基酸產(chǎn)量與對照相比提高了8倍左右[20].紫杉醇是從紅豆杉皮中提取的一種高效而罕見的抗腫瘤藥物，但其提取方法成本高、產(chǎn)率低，限制了它的廣泛應用.Qiao W發(fā)現(xiàn)NaOAc是紫杉醇的重要前體，可在培養(yǎng)基中引入NaOAc、Cu2+和水楊酸，Cu2+可增強氧化酶活性，能催化紫杉醇的形成.水楊酸可作為誘導子信號[21].

2.4 其他微生物優(yōu)化

植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生需要葉綠體和膜功能的作用，更需要其他微生物的調(diào)節(jié).Raupach[22]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過7種根桿菌(PGPR)菌株處理的黃瓜都具有顯著生長，且所有經(jīng)過PGPR治療的黃瓜都顯著地降低了葉病的嚴重程度，進而提高生產(chǎn)效率.Vijayakumar R[23]對采集的25份放線菌樣品進行了分離，獲得68株形態(tài)不同的菌株，其中37%具有抗菌活性，取名為鏈霉菌VPTS3-1.其對細菌和真菌病原體具有抗菌效果.此外制備工藝參數(shù)表明，在淀粉-酪蛋白培養(yǎng)基中，適宜的pH值為7～8，培養(yǎng)時間為9 d，適宜的碳源為淀粉，氮源為KNO3，可為大規(guī)模生產(chǎn)提供培養(yǎng)條件.

3 總結(jié)與展望

放線菌及其代謝產(chǎn)物是維持生命的關鍵，也是自然過程的驅(qū)動力.將放線菌及其代謝次生物用于抵抗各種病原體的侵入和生物蟲害，還可參與納米材料的大規(guī)模生產(chǎn)并能促進生產(chǎn)效率的優(yōu)化.他們的生物合成潛力已被充分認識，不再被認為是無研究價值的放線菌群，還具有無限的發(fā)展?jié)撃?隨著生物與化學技術(shù)的不斷發(fā)展，新型篩選技術(shù)將更具有針對性，并能減少重復概率，還可使代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量進一步提高，達到可控的效果.

目前對放線菌及其代謝產(chǎn)物的研究應用遠遠不夠，還需要關注新的菌種，如鏈球菌、乳桿菌在代謝產(chǎn)物方面的應用；新領域微生物資源的開發(fā)，對植物相關菌種在不同條件下的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)能和應用，以及對新型代謝途徑的研究；還如鏈球菌在脫硫方面的不同代謝途徑是否可產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物等等.這些不同方面的探索可促進對放線菌代謝產(chǎn)物的深入研究.無論在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療還是工業(yè)領域，放線菌屬都有廣闊的應用前景和開發(fā)空間，值得深入研究.