劉新宇 張倩 孫倩

耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)是我國(guó)結(jié)核病疫情控制的主要障礙，加劇了對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生的威脅。因此，迫切需要改進(jìn)現(xiàn)有的治療方案和開(kāi)發(fā)新的抗結(jié)核藥品?；谟行耘c安全性，世界衛(wèi)生組織于2018年發(fā)布了新的MDR-TB治療指南，將藥物重新歸為三類(lèi)[1]。但關(guān)于這幾種藥物在北京市昌平區(qū)MDR-TB患者中的耐藥特點(diǎn)仍然未知。本研究通過(guò)分析A組藥品中的左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)和利奈唑胺(linezolid，Lzd)，B組藥品中的氯法齊明(clofazimine，Cfz)，以及C組藥品中的德拉馬尼(delamanid，Dlm)對(duì)MDR-TB臨床分離株的體外抑菌活性，初步了解北京市昌平區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)這幾種藥品的敏感性和耐藥突變類(lèi)型，為藥品的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

材料和方法

一、研究材料

2011—2015年北京市昌平區(qū)結(jié)核病防治所從收治的結(jié)核病患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)及菌種鑒定后共獲得1099株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，收集其中耐多藥結(jié)核分枝桿菌(83株，占7.6%)作為研究資料。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)由國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

二、研究方法

1. 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)藥物敏感性(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏”)檢測(cè)：對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌按照文獻(xiàn)[2]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Lfx、Mfx、Lzd、Bdq、Cfz和Dlm的MIC檢測(cè)。每種藥品的臨界濃度見(jiàn)表1[3-5]。

表1 藥物最小抑菌濃度范圍和臨界濃度

2. DNA提取和耐藥基因檢測(cè)：將結(jié)核分枝桿菌臨床分離株接種于L-J培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4～8周，至有菌落生長(zhǎng)后，取一接種環(huán)菌于400 μl TE緩沖液(pH 值為8.3)中懸菌，100 ℃煮沸15 min，在8 cm離心半徑下以12 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃保存?zhèn)溆肹6]。耐藥基因用相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增(表2)。25 μl反應(yīng)體系：包括2×PCR TaqSuperMix預(yù)混液12.5 μl、引物(10 mol/L)各 0.5 μl，模板5 μl，去離子水6.5 μl。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃ 變性 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共 35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸 10 min。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序均委托北京擎科生物有限公司完成。采用Bioedite軟件將耐藥基因測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì)分析。

表2 擴(kuò)增和測(cè)序引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Excel 2010錄入數(shù)據(jù)，通過(guò) Backlink程序轉(zhuǎn)換為Whonet文件，導(dǎo)入 Whonet 5.6軟件，采用數(shù)值比例法對(duì)耐藥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株耐藥特征

83株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)不同藥品的耐藥情況見(jiàn)表3。耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx和Mfx的耐藥率最高，均為41.0%；其中，39株對(duì)Lfx或Mfx耐藥，29株對(duì)Lfx和Mfx交叉耐藥。耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)Bdq的耐藥率最低，為2.4%。對(duì)Cfz的耐藥率為3.6%；3株Cfz耐藥菌株中有2株對(duì)Bdq耐藥。

表3 83株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)不同藥品的耐藥情況

二、耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變情況

1. 氟喹諾酮類(lèi)藥品耐藥基因突變：39株對(duì)Lfx或Mfx耐藥的菌株中，gyrA基因的第94位密碼子的堿基替換是最常見(jiàn)的突變類(lèi)型，占87.2%(34/39)；其中13株(33.3%，13/39)突變類(lèi)型為Asp94Gly，11株(28.2%，11/39)突變類(lèi)型為Asp94Tyr，6株(15.4%，6/39)突變類(lèi)型為Asp94Ala，4株(10.3%，4/39)突變類(lèi)型為Asp94Asn；第90位密碼子的Ala90Val為第二常見(jiàn)的突變類(lèi)型。所有耐藥菌株均在gyrA基因的第95位密碼子存在Ser95Thr突變類(lèi)型，但Ser95Thr突變與耐藥無(wú)關(guān)。在gyrB基因中未發(fā)現(xiàn)非同義突變。見(jiàn)表4。

表4 耐藥菌株的耐藥基因突變類(lèi)型

2. 其他藥品耐藥基因突變：3株Cfz耐藥菌株在rv1979c基因中均未發(fā)現(xiàn)突變。在Bdq耐藥菌株中也未發(fā)現(xiàn)atpE基因突變。2株Cfz-Bdq交叉耐藥菌株均在Rv0678基因中存在突變，1株突變類(lèi)型為Gln31Arg，另一株突變類(lèi)型為Ser53Pro。在4株 Lzd耐藥菌株中，有2株在rplC基因中存在突變，突變類(lèi)型為Cys154Arg，而在23SrRNA基因和rplD基因中均未發(fā)現(xiàn)突變。在4株Dlm耐藥菌株中，1株突變發(fā)生在fbiC基因的第318位密碼子，2株突變發(fā)生在ddn基因的第81位密碼子，而在fbiA、fbiB和fgd1基因中均未發(fā)現(xiàn)突變。

討 論

目前，MDR-TB已成為阻止全球結(jié)核病控制的一大障礙。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的MDR-TB治療方案，筆者分析了A、B和C組常用藥品的耐藥特點(diǎn)，并闡明了這些耐藥菌株的遺傳突變特征，為臨床用藥提供指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果顯示，北京市昌平區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx和Mfx耐藥率均為41.0%。來(lái)自中國(guó)東部地區(qū)的一項(xiàng)研究表明，耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥品的耐藥率為37%[7]。中國(guó)南方地區(qū)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx和Mfx的耐藥率分別為76%和73%[8]。另一份來(lái)自上海的報(bào)告顯示，在耐氟喹諾酮類(lèi)藥品的結(jié)核分枝桿菌中，44%為耐多藥結(jié)核分枝桿菌[9]。我國(guó)氟喹諾酮類(lèi)藥品的耐藥率高，可能是由于患者在治療未確診的細(xì)菌感染時(shí)存在過(guò)度使用，表明在臨床實(shí)踐中需要采取迫切行動(dòng)來(lái)控制氟喹諾酮類(lèi)藥品的濫用。Mokrousov等[10]的研究顯示，87.2%的氟喹諾酮類(lèi)藥品耐藥菌株在gyrA基因的耐藥決定區(qū)存在突變，其中第94位密碼子是最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，但未發(fā)現(xiàn)gyrB基因突變。第94位密碼子的突變頻率(87.2%)與俄羅斯報(bào)道的83%相似，但高于中國(guó)香港的75%[11]和盧旺達(dá)的75%[12]，表明gyrA基因的耐藥決定區(qū)突變是導(dǎo)致北京市昌平區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐氟喹諾酮類(lèi)藥品的關(guān)鍵因素。

本研究中，95%以上的耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)Bdq和Cfz敏感。盡管目前這兩種藥品是MDR-TB治療方案的組成部分，但研究發(fā)現(xiàn)Rv0678基因突變能夠促進(jìn)外排泵MmpS5-MmpL5過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致這兩種藥品出現(xiàn)交叉耐藥[13]，與文獻(xiàn)[14]的研究結(jié)果一致。本研究的數(shù)據(jù)表明，3株Cfz耐藥菌株中有2株存在Rv0678基因突變，且對(duì)Bdq存在交叉耐藥。而在無(wú)Rv0678基因突變的Cfz耐藥菌株中，未發(fā)現(xiàn)Rv1979c基因突變。因此，需要通過(guò)鑒定新的突變位點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)對(duì)Cfz耐藥機(jī)制的深入了解。雖然孫晴等[14]的研究表明，atpE基因突變與Bdq耐藥有關(guān)，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)atpE基因突變，其他的機(jī)制可能參與Bdq耐藥。

Lzd可有效治療MDR-TB，根據(jù)以往的研究表明，rplC基因的T460C突變是Lzd耐藥菌株中最常見(jiàn)的突變類(lèi)型[15]。本研究中，50%的MDR-TB臨床分離株中存在rplC基因突變，這與之前報(bào)道的一致。此外，Schena等[5]研究表明，ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC任一基因的多態(tài)性均可導(dǎo)致Dlm體外耐藥。其中，ddn基因編碼一種依賴(lài)于F420的分枝桿菌硝基還原酶，與前藥激活有關(guān)[14]。最近一項(xiàng)研究表明，10株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株中有5株在ddn基因中存在突變[16]。而在本研究中共鑒定了2株含有ddn基因突變的耐多藥結(jié)核分枝桿菌。FbiC基因作為輔酶F420生物合成途徑的重要成員[17]，也參與了Dlm的耐藥。在本研究中，3株 Dlm耐藥菌株中，有1株在FbiC基因中存在突變，表明FbiC基因突變是導(dǎo)致Dlm耐藥的重要因素。

綜上所述，北京市昌平區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥品耐藥率較高，而對(duì)Bdq、Lzd、Dlm和Cfz表現(xiàn)出較好的敏感性。研究結(jié)果可為MDR-TB患者選藥時(shí)進(jìn)行參考，為北京市昌平區(qū)應(yīng)用新型抗結(jié)核藥品治療MDR-TB提供理論依據(jù)。