李國(guó)斌

華寶香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

防己為防己科植物粉防己（Stephania tetrandraS.Moore）的干燥根，性味苦、寒，歸膀胱、肺經(jīng)，為我國(guó)常用的中藥藥材，主產(chǎn)于浙江、廣東、廣西、安徽、福建等地，具有利水消腫、祛風(fēng)止痛的功效[1-3]。防己中成分復(fù)雜，含生物堿、揮發(fā)油、糖類、黃酮類等，藥理學(xué)研究試驗(yàn)表明黃酮類成分為其主要藥效成分，該成分具有改善血液循環(huán)、提高免疫力的作用[4-7]。防己中的活性黃酮類物質(zhì)包括蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素等，其功效組分的解析及功能的進(jìn)一步利用有待深入研究[8-9]。試驗(yàn)以不同產(chǎn)地防己藥材為研究對(duì)象，對(duì)其活性黃酮類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定及其在卷煙中的應(yīng)用。

對(duì)防己提取物中蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素的測(cè)定方法主要為分光光度法，但分光光度法用于測(cè)定單一黃酮物質(zhì)的量或濃度，估算混合物或提取物中總黃酮物質(zhì)含量，不能對(duì)各種黃酮物質(zhì)分別定量；薄層色譜法和柱層析法能對(duì)多種黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離，雖然成本可控，但耗時(shí)長(zhǎng)，難以控制重復(fù)性和準(zhǔn)確率；高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最廣也最適用于黃酮物質(zhì)的分離測(cè)定方法。

試驗(yàn)采用高效液相色譜、梯度洗脫及靈敏度更高的DAD檢測(cè)建立防己提取物中5種黃酮物質(zhì)的測(cè)定方法，并對(duì)其精確度、回收率等進(jìn)行評(píng)價(jià)；比較不同來(lái)源防己提取物對(duì)其5種黃酮物質(zhì)含量的影響，以期為防己提取物的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

美國(guó)瓦里安PROSTAR230高效液相色譜儀（配有輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線脫氣裝置及化學(xué)工作站）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（濰坊市精華粉體工程設(shè)備有限公司）；離心機(jī)（盧湘儀集團(tuán)）；渦流混合器；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒公司）；AL2002電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；0.45 μm及0.22 μm針頭微孔濾膜過(guò)濾器、乙酸（色譜純）、甲醇（色譜純）（均購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司）；Biocel型密理博超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及流動(dòng)相的制備

1.2.1 黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品

蘆?。兌取?9.0%）、槲皮素（純度≥99.0%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（純度≥99.0%）、山奈酚（純度≥99.0%）、異鼠李素（純度≥99.0%）（均購(gòu)自Flucker公司）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液

以密理博超純水配制黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度0.1 mg/mL，并于4 ℃冰箱儲(chǔ)存；分別取以上標(biāo)樣液，用密理博超純水配制成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1 000.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品工作液，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。流動(dòng)相A相，0.25%乙酸水溶液；流動(dòng)相B相，90%甲醇水溶液。

1.3 色譜分析條件

SYMMETRYSHIELD RP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～5.0 min，90%～80% A；5.0～35.0 min，80%～0% A；35.0～40.0 min，0%～90% A。進(jìn)樣量10.0 μL；流速0.80 mL/min；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm；柱溫40 ℃。

1.4 防己提取物樣品處理

防己提取物的配制：分別稱取2.000 0 g水提法得到的廣東潮州產(chǎn)防己提取物、廣西崇左防己提取物、湖南郴州產(chǎn)防己提取物、湖北潛江產(chǎn)防己提取物，用40 mL 90%甲醇水溶液，溶解于100 mL棕色容量瓶中，置于搖床上振蕩提取40 min；靜置10 min，將有機(jī)相層轉(zhuǎn)移并在25 ℃定容到100 mL后，儲(chǔ)存于1～4 ℃冰箱，用前稀釋到所需濃度。

1.5 供試樣品溶液的制備

將1.4小節(jié)得到的提取液以濾紙過(guò)濾，將濾液用90%甲醇水溶液定容于25 mL容量瓶，搖勻后0.45 μm濾膜過(guò)濾，以10 000 r/min離心10 min后再用高效液相色譜分析，外標(biāo)法定性定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品色譜圖

基于該方法的色譜條件結(jié)合DAD檢測(cè)器對(duì)5種黃酮類物質(zhì)標(biāo)樣進(jìn)行最大吸收光譜掃描，掃描波長(zhǎng)190～400 nm。分析不同黃酮類物質(zhì)的最大吸收光譜，5種黃酮類物質(zhì)在282 nm左右均有較大吸收峰，因此，選取282 nm作為黃酮類物質(zhì)的定量檢測(cè)波長(zhǎng)。按照方法提供的液相色譜分離和分析條件，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和廣東潮州產(chǎn)防己提取物、廣西崇左防己提取物、湖南郴州產(chǎn)防己提取物、湖北潛江產(chǎn)防己提取物供試樣品溶液各10.0 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，分析結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，色譜峰尖銳，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.7，理論塔板數(shù)均大于3 400，滿足黃酮類物質(zhì)定量要求。

圖1 黃酮類物質(zhì)混合標(biāo)樣（A）和廣東潮州產(chǎn)防己提取物樣品液相色譜圖（B）

2.2 檢測(cè)方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍及檢出限

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋0，5，10，20，50和100倍，吸取6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 μL進(jìn)行測(cè)定。以各色譜峰峰面積積分值（Y）對(duì)其濃度（X）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，5種成分至少在0.03～200 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990 0），檢出限（S/N=3）在0.004～0.04 mg/kg，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 黃酮類物質(zhì)的線性關(guān)系（n=6）

2.2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取10.0 μL標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄5種組分的峰面積，計(jì)算得蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的δRSD（n=6）分別為2.97%，1.76%，3.11%，2.47%和2.97%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取廣東潮州產(chǎn)防己提取物供試樣品溶液，在0～24 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣1次，分別記錄5種組分的峰面積，計(jì)算得蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的δRSD（n=6）分別為2.36%，3.77%，3.62%，2.85%和1.42%，表明供試樣品溶液中5種組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份廣東潮州產(chǎn)防己提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下測(cè)得蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的δRSD（n=6）分別為3.36%，2.66%，3.29%，2.64%和3.25%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取6份廣東潮州產(chǎn)防己提取物（蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素含量分別是92.82，12.53，9.78，31.89和16.48 mg/kg，總計(jì)黃酮物質(zhì)含量為163.49 mg/kg），每份3.00 g，精密稱定，置于50.0 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3個(gè)不同濃度的蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（10.0，50.0和100.0 mg/kg），按照前述制備供試樣品溶液，在高效液相色譜的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率的結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的平均回收率（n=6）分別為87.76%，89.45%，105.27%，102.36%和89.33%；δRSD（n=6）分別為2.18%，1.30%，2.55%，2.45%和3.34%。

表2 防己提取物加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

分別取上述防己提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5種組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

不同防己提取物中蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素總含量由高到低為防己（廣東潮州）＞防己（湖北仙桃）＞防己（湖南郴州）＞防己（湖北潛江）。

3 防己提取物在卷煙中的應(yīng)用

廣東潮州產(chǎn)防己提取物、廣西崇左防己提取物、湖南郴州產(chǎn)防己提取物、湖北潛江產(chǎn)防己提取物分別在卷煙中按加表香的形式添加0.01%，儲(chǔ)放2 h后，制備成卷煙，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其結(jié)果如表4所示。

表4 不同防己提取物在卷煙中的作用評(píng)價(jià)

4個(gè)地區(qū)產(chǎn)的防己提取物都有增加煙氣濃度、香氣量和厚實(shí)性的效果，不同地區(qū)防己提取物香味和口感有所不同，廣西崇左產(chǎn)防己提取物會(huì)帶點(diǎn)青滋香，偏酸，尖刺會(huì)表現(xiàn)出來(lái)；湖南郴州產(chǎn)防己提取物濃度、爆發(fā)力更強(qiáng)，煙氣也會(huì)粗獷些，同時(shí)喉部會(huì)刺激大；湖北潛江產(chǎn)防己提取物濃度、香氣量和厚實(shí)都有所增加，但煙氣顯得沉悶些，余味干凈度不夠；廣東潮州產(chǎn)防己提取物綜合指標(biāo)比較好，沒(méi)有明顯的負(fù)面作用。

以廣東潮州產(chǎn)防己提取物在不同檔次卷煙中添加不同用量進(jìn)行比較，選擇最佳投放量和應(yīng)用效果。按添加量0.005%，0.010%，0.015%和0.020%分別加入中檔和高檔卷煙進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。在中檔卷煙中，添加量0.005%時(shí)，濃度、香氣量略有增加，細(xì)膩度較好，口感較舒適；添加量為0.010%和0.015%時(shí)，增加濃度、香氣量和厚實(shí)性差別不明顯，口感也無(wú)明顯差異，添加量為0.015%時(shí)體現(xiàn)防己提取物的個(gè)性香味稍微高一點(diǎn)；添加量為0.020%時(shí)，防己提取物的個(gè)性香味顯現(xiàn)，但有一點(diǎn)抑制煙草本香的負(fù)面效果，有變粗、濃的趨勢(shì)。中檔卷煙一般追求濃度、香氣量和滿足感，總之防己提取物添加量為0.010%和0.005%時(shí)效果均不錯(cuò)，但添加量0.010%更合適中檔卷煙。高檔卷煙一般要求香氣質(zhì)高、香氣量足，口感好，故在高檔卷煙中防己提取物添加量0.005%效果最佳，香氣優(yōu)雅細(xì)膩諧調(diào)，口感也較好。

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定防己提取物及不同來(lái)源得到的防己提取物中蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素5種黃酮物質(zhì)的含量，初步比較不同提取方法對(duì)5種黃酮物質(zhì)含量的影響。檢測(cè)方法顯示，5種成分至少在0.03～200 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990 0）；檢出限（S/N=3）在0.004～0.04 mg/kg，加標(biāo)回收率在87.76%～105.27%，檢測(cè)方法靈敏有效。相對(duì)而言，廣東潮州產(chǎn)防己提取物的功效最為明顯，這與對(duì)黃酮物質(zhì)中含量的試驗(yàn)結(jié)果一致。

不同來(lái)源防己提取物在卷煙中的功能作用基本類似，都有增加香氣量、濃度和厚實(shí)度的效果，但是刺激性和余味上及煙氣的細(xì)膩度上表現(xiàn)有所差異。相對(duì)來(lái)說(shuō)廣東潮州產(chǎn)防己刺激性增加不明顯，余味還保持較干凈舒適，煙氣細(xì)膩度較好，綜合品質(zhì)及在卷煙中的應(yīng)用價(jià)值比較高。通過(guò)在不同檔次卷煙中不同添加量的試驗(yàn)，防己提取物在中檔卷煙中添加量為0.010%時(shí)最佳，在高檔卷煙中添加量0.005%最佳。