王巖，王磊，鄭百芹，王帥，趙海濤，李彤

1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（唐山 063000）；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）；3.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（唐山 063000）

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PGRs）是一類與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，也被稱為植物天然激素或植物內(nèi)源激素，可影響和有效調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，包括從細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂，到生根、發(fā)芽、開花、結(jié)實(shí)、成熟和脫落等一系列植物生命全過程。近年來，濫用及不當(dāng)使用PGRs的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，影響農(nóng)產(chǎn)品的食用安全，對(duì)人民健康造成威脅[1-4]。原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局、原農(nóng)業(yè)部及原國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的2015年11號(hào)公告中明令禁止在豆芽中使用6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸和赤霉素等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類物質(zhì)。因此，開展豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留的快速檢測(cè)新技術(shù)研究，對(duì)保證食品安全、促進(jìn)國(guó)民健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

中國(guó)關(guān)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的多殘留檢測(cè)技術(shù)和有關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)研究處于起步階段，多殘留同時(shí)檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。有關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫（ELISA）法[5]、氣相色譜（GC）法[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法[7]、高效液相色譜（HPLC）法[8]、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[9]。GC和GC-MS/MS需要進(jìn)行化學(xué)衍生，操作較為繁瑣。ELISA靈敏度較低，難以實(shí)現(xiàn)痕量分析。HPLC的靈敏度較低，基質(zhì)干擾影響較大，前處理復(fù)雜并且容易造成假陽(yáng)性干擾。HPLC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，在滿足復(fù)雜基質(zhì)痕量殘留分析的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)多殘留化合物的同時(shí)分析，是PGRs殘留分析的優(yōu)選方法。試驗(yàn)采用QuEChERS方法結(jié)合HPLC-MS/MS測(cè)定豆芽中18種PGRs的殘留量，旨在為標(biāo)準(zhǔn)的修訂及有效監(jiān)控豆芽中的PGRs殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460型HPLC-MS/MS（安捷倫科技（中國(guó)）有限公司）；099ADPM12型渦旋混勻儀（上海易擴(kuò)儀器有限公司）；3-15型高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；EVA50A型氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司）；T-200電子天平（常熟雙杰儀器制造廠）；SZ13022-NY 0.22 μm有機(jī)濾膜（天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司）。

18種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品：氯吡脲、赤霉酸、環(huán)丙酸酰胺、脫落酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、對(duì)氯苯氧乙酸、噻苯隆、6-芐氨基嘌呤、4-碘苯氧基乙酸、抑芽唑、2, 4-D、萘乙酸、烯效唑、抗倒胺、多效唑、吲哚丁酸、抗倒酯（純度≥99.0%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；C18、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（上海安譜公司）；甲醇、甲酸、乙腈、NH4AC（色譜純，美國(guó)ASC公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸（分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Phenomenex H18（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫35 ℃。流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇。梯度洗脫：0.5～5.0 min，10% B；5.0～8.0 min，95% B；8.0～12 min，10% B；流速0.25 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正（ESI+）、負(fù)（ESI-）離子掃描方式；霧化氣流量3.00 L/min；干燥氣流量15.00 L/min；DL管溫度250 ℃；電噴霧電壓（IS）2 500 V；掃描時(shí)間0.1 s；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取100 μL質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的單個(gè)PGR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。取樣品空白溶液分別配制0.005，0.01，0.020，0.040和0.050 μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 樣品前處理

稱取5.0 g豆芽樣品于離心管外管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（外標(biāo)法），靜置30 min，加入10 mL 5%乙酸-乙腈（1∶99，V/V），加入萃取鹽包（內(nèi)含5.5 g無水硫酸鎂、1.5 g氯化鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉和1.0 g檸檬酸鈉）及10顆鋯珠，擰緊內(nèi)管（內(nèi)含4 mm氧化鋯珠5粒、200 mg PSA、500 mg無水硫酸鎂和100 mg C18）后放入自動(dòng)QuEChERS前處理儀器中開始處理，經(jīng)25 min交替振蕩離心后，準(zhǔn)確吸取1.0 mL上清液氮吹近干，用10%甲醇溶液定容，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜，濾液供HPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取1 000 μg/L的18種PGRs標(biāo)準(zhǔn)溶液通過針泵注入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，掃描范圍m/z50～500，得到18種PGRs的一級(jí)質(zhì)譜圖。由于18種PGRs的性質(zhì)不同，其電離方式也有所差異，因此確定其合適的電離方式，以達(dá)到最高的電離效果。選擇響應(yīng)最高的離子作為準(zhǔn)分子離子，優(yōu)化去簇電壓（DP），以獲得最強(qiáng)的母離子信號(hào)，并選擇響應(yīng)較強(qiáng)的2個(gè)離子作為定量離子和定性離子，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，優(yōu)化碰撞能（CE）。質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 18種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較Phenomenex H18色譜柱（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）、Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 m，3.5 μm）和Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，7.0 μm）對(duì)待測(cè)物的分離效果，結(jié)果表明，18種PGRs在Phenomenex H18色譜柱上的分離效果和峰形最好。因此，試驗(yàn)選擇Phenomenex H18色譜柱分析待測(cè)物。

試驗(yàn)比較乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相的分離效果，考察其對(duì)18種PGRs的洗脫效果，結(jié)果表明，使用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，18種待測(cè)物在色譜柱上的保留時(shí)間最短，分離效果和峰形更好，因?yàn)榧状甲鳛橛袡C(jī)相時(shí)，待測(cè)物具有更高的響應(yīng)值和靈敏度。試驗(yàn)表明，流動(dòng)相中加入甲酸會(huì)使待測(cè)物的離子化，而乙酸銨對(duì)負(fù)離子模式下目標(biāo)物的離子化效果具有促進(jìn)作用。分別配制濃度為：1）0.1%甲酸-1 mmol/L乙酸銨-甲醇；2）0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨-甲醇；3）0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨-甲醇；4）0.3%甲酸-5 mmol/L乙酸銨-甲醇的流動(dòng)相，試驗(yàn)結(jié)果表明0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)物的響應(yīng)和峰形均為最優(yōu)。在最優(yōu)洗脫條件下，18種PGEs的保留時(shí)間在5.8～11.7 min。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

分散固相萃取技術(shù)（QuEChERS，即quick，easy，cheap，effective，rugged and safe），是近年來國(guó)際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，其主要通過極性相互作用、非極性相互作用、離子相互作用等方式保留基質(zhì)干擾成分，達(dá)到凈化效果。主要的吸附材料有石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）和C18，其中PSA主要對(duì)極性物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用，去除有機(jī)酸、色素、金屬離子和酚類等物質(zhì)；GCB可有效去除色素；C18對(duì)非極性物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附作用。試驗(yàn)選擇50 μg/L的混標(biāo)質(zhì)量濃度，考察（1）100 mg C18+25 mg GCB+500 mg MgSO4；（2）100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4；（3）25 mg GCB+200 mg PSA+500 mg MgSO4；（4）100 mg C18+200 mg PSA+25 mg GCB+500 mg MgSO44種條件下的凈化效果和加標(biāo)回收率，結(jié)果見圖1。其中，采用100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4為凈化劑時(shí)，18種PGRs的回收率在80%～115%，因此，采用100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4作為樣品凈化的吸附劑。

圖1 18種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在不同凈化組合中的回收率（n=3）

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

基質(zhì)效應(yīng)是一個(gè)常見干擾因子，指樣品共提取的基質(zhì)會(huì)影響目標(biāo)物的離子化，產(chǎn)生的共提取物存在基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，采取適當(dāng)?shù)姆椒p少或消除，可以提高測(cè)定準(zhǔn)確度和精密度。試驗(yàn)以不含目標(biāo)物的豆芽樣品作為空白基質(zhì)，采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。取質(zhì)量濃度分別為0.005，0.010，0.020，0.040和0.050 μg/mL系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，18種PGRs在質(zhì)量濃度范圍0.005～0.05 μg/mL時(shí)具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均≥0.999 0。以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算方法定量限（LOQ），結(jié)果顯示，18種PGRs的LOD為0.3～1.2 μg/kg，LOQ為1.0～5.0 μg/kg（表2）。

表2 18種PGRs的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4.2 方法的回收率和精密度

以不含目標(biāo)組分的5.0 g豆芽樣品作為空白基質(zhì)，添加18種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制添加質(zhì)量濃度水平為10，100和200 μg/kg的樣品各3份，每個(gè)質(zhì)量濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）。由表3可知，各添加質(zhì)量濃度水平的平均回收率為85%～110%，δRSD為2.8%～7.5%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足殘留分析的要求。

表3 18種PGRs添加回收率和精密度（n=6）

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所建立的分析方法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買的30批次豆芽樣品進(jìn)行檢測(cè)，在受檢樣品中，其中有3個(gè)批次樣品檢出4-氯苯氧乙酸（4-CPA），其含量低于定量限；2個(gè)批次樣品檢出6-芐基腺嘌呤（6-BA），質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.4和10.6 μg/kg，為不合格樣品。其他16種PGRs均未檢出。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用5%乙酸-乙腈（1∶99，V/V）作為提取溶劑，利用QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，建立豆芽中18種PGRs的HPLCMS/MS同時(shí)測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，精確度和準(zhǔn)確度均滿足方法學(xué)指標(biāo)，可用于同時(shí)測(cè)定豆芽中18種PGRs殘留量。