李根容，余文琴，肖昭競(jìng)，童蘭艷

1.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院（重慶 401123）；2.國(guó)家農(nóng)副加工產(chǎn)品及調(diào)味品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（重慶 401123）

酚類化合物苯酚、對(duì)苯二酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚以及4-氯-3, 5-二甲基苯酚作為常用的農(nóng)藥助劑及農(nóng)藥中間體，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥行業(yè)[1-2]。同時(shí)上述酚類化合物也是中高毒性的化學(xué)物質(zhì)，部分屬持久性污染物[3]。我國(guó)規(guī)定水中揮發(fā)酚類（以苯酚計(jì)）不超過(guò)0.002 mg/L[4]，苯酚、間甲酚在我國(guó)水中優(yōu)先污染物黑名單上，苯酚、4-氯-3, 5-二甲基苯酚則在美國(guó)EPA水環(huán)境中129種優(yōu)先污染物名單上。2015年，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所起草并發(fā)布了《農(nóng)藥助劑禁限用名單》（征求意見稿），明確規(guī)定農(nóng)藥制劑中禁止使用對(duì)苯二酚、苯酚，并規(guī)定間甲酚和對(duì)甲酚含量不能超過(guò)0.1%，鄰甲酚和4-氯-3, 5-二甲基苯酚含量不能超過(guò)1%。農(nóng)藥的大量使用使得蔬菜等農(nóng)作物不可避免地被農(nóng)藥中酚類化合物污染。研究蔬菜等農(nóng)作物中酚類化合物的殘留檢測(cè)方法有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前上述酚類化合物的檢測(cè)方法有分光光度法[5]、電化學(xué)法[6]、液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13]等。前處理主要采用直接萃取[14]、固相萃取[15-16]和固相微萃取[17-18]等方法，也有采取衍生化操作以提高酚類化合物在氣相色譜或者氣質(zhì)聯(lián)用上響應(yīng)的應(yīng)用[19-21]，但是操作較為繁瑣。目前尚未見蔬菜中酚類化合物殘留的相關(guān)研究，由于蔬菜樣品基質(zhì)復(fù)雜，故試驗(yàn)采用固相萃取富集并純化蔬菜中酚類化合物，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用選擇性檢測(cè)目標(biāo)化合物，既可保證凈化效果，又能快速高效檢測(cè)蔬菜中酚類化合物殘留。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）：配備有EI離子源和AOC-20i型自動(dòng)進(jìn)樣器；SQP QUINTIX224-1CN型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；QT-2A渦旋混勻器（上海琪特分析儀器有限公司）；Jipad-24SPE固相萃取儀（上海旌派儀器有限公司）。

丙酮（農(nóng)殘級(jí)，J.T.Baker試劑公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；正己烷、甲醇、乙酸乙酯（色譜純，德國(guó)Merk公司）；三氯甲烷（AR，重慶川東化工有限公司）；濃鹽酸（GR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（CAS 108-95-2，99.90%）、鄰甲酚（CAS 95-48-7，99.57%）、間甲酚（CAS 108-39-4，99.52%）、對(duì)甲酚（CAS 106-44-5，99.49%）、對(duì)苯二酚（CAS 123-31-9，99.51%）、4-氯-3, 5-二甲基苯酚（CAS 88-04-0，99.55%）：LGC公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取適量各農(nóng)藥助劑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯配制質(zhì)量濃度為1.0×103mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-18 ℃避光保存。分別取適量單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯稀釋配制質(zhì)量濃度為10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（其中4-氯-3, 5-二甲基苯酚質(zhì)量濃度為20 mg/L，對(duì)苯二酚質(zhì)量濃度為50 mg/L），使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g（精確至0.01 g）蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入約20.0 mL水，渦旋混勻后振蕩提取20 min，以5 000 r/min離心5 min，收集所有上清液調(diào)節(jié)pH 2.0左右，待凈化。

依次用6.0 mL乙酸乙酯、6.0 mL甲醇活化HLB固相萃取小柱，再用6.0 mL水平衡后將上述收集上清液全部上柱富集。再用5.0 mL乙酸乙酯洗脫目標(biāo)物，加入適量無(wú)水硫酸鈉除水，于40 ℃氮吹濃縮至1.0 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜上GC-MS測(cè)定，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：SH-Rtx-WAX氣相色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度180 ℃；升溫程序：50 ℃保持1 min，以30 ℃/min 升溫至180 ℃，保持0 min，然后10 ℃/min升溫至245 ℃，保持10 min；進(jìn)樣模式，不分流進(jìn)樣；柱流量1.0 mL/min；載氣，高純He，純度≥99.999%；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），電子轟擊能量70 eV，離子源溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲時(shí)間7 min；質(zhì)譜掃描方式，選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIM）。6種酚類化合物的保留時(shí)間、定量和定性離子見表1。

表1 6種酚類化合物的保留時(shí)間、定量離子、定性離子

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取小柱的選擇

由于部分高色素含量蔬菜樣品（如韭菜）基質(zhì)干擾嚴(yán)重，為了減少基質(zhì)引入的干擾，選擇固相萃取小柱凈化提取液。固相萃取凈化一般分為兩種模式，一種為目標(biāo)化合物保留模式，另一種為雜質(zhì)保留模式[22]。此次試驗(yàn)研究的6種酚類化合物具有相似的化學(xué)性質(zhì)，故考慮采取目標(biāo)化合物保留模式，選擇對(duì)比了C18，HLB和PLS三種固相萃取小柱的加標(biāo)回收率。依次用6.0 mL乙酸乙酯、6.0 mL甲醇活化，再用6.0 mL水平衡后將加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的水溶液（pH 2.0～3.0）全部上柱富集。再用6.0 mL上樣溶液淋洗固相萃取小柱，用5.0 mL乙酸乙酯洗脫目標(biāo)物，加入適量無(wú)水硫酸鈉除水，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上GC-MS測(cè)定，結(jié)果見圖1。C18固相萃取小柱對(duì)于苯酚的回收率偏低（＜70%），對(duì)苯二酚在PLS固相萃取小柱的回收率偏低（＜40%）；HLB固相萃取小柱對(duì)6種酚類化合物均有較好的回收，故選擇HLB固相萃取小柱進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 不同固相萃取小柱對(duì)6種酚類化合物回收率的影響（n=4）

2.2 上柱溶液pH的優(yōu)化

待測(cè)6種酚類化合物均帶有酚羥基，在不同pH條件下呈不同狀態(tài)，故上樣溶液pH對(duì)固相萃取的回收率會(huì)產(chǎn)生較大影響，故以回收率為指標(biāo)，考察了上樣溶液在不同的pH條件下（pH 2.0，4.0，6.0，8.0和10.0）對(duì)于目標(biāo)化合物回收率的影響。圖2表明，隨著pH的升高，6種酚類化合物的回收率均明顯降低，在酸性條件下6種化合物均有較好的回收，且在pH 2.0左右回收率最高，這是由于酚類物質(zhì)在酸性條件下以中性分子形態(tài)，疏水性較強(qiáng)，能在反相柱上有較好的保留，在堿性條件下酚類化合物電離呈離子狀態(tài)，親水性增強(qiáng)，無(wú)法與反相柱相互作用，導(dǎo)致保留減弱甚至無(wú)保留。因此，提取后的上柱溶液應(yīng)調(diào)節(jié)pH到2.0左右。

圖2 不同pH對(duì)6種酚類化合物回收率的影響

2.3 洗脫溶劑的選擇

在其他條件不變的前提下，考察了三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇4種不同溶劑對(duì)6種酚類化合物的洗脫效率，洗脫溶劑用量5.0 mL。由圖3可知，甲醇和三氯甲烷對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果偏低，乙酸乙酯和丙酮的洗脫效果較好，但是丙酮由于洗脫能力太強(qiáng)，導(dǎo)致上樣溶液雜質(zhì)含量較多，為了避免丙酮帶入的雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)定量造成的干擾，選擇乙酸乙酯作為洗脫溶劑。

圖3 不同洗脫溶劑對(duì)6種酚類化合物回收率的影響（n=3）

2.4 色譜柱選擇

考察了6種酚類化合物在通用弱極性毛細(xì)管柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和強(qiáng)極性毛細(xì)管柱H-Rtx-WAX（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）上的分離效果。結(jié)果表明，酚類化合物在HP-5毛細(xì)管柱上峰拖尾嚴(yán)重，峰型矮胖不對(duì)稱，在較早出峰的化合物上表現(xiàn)更為明顯。而在H-Rtx-WAX各個(gè)組分峰型對(duì)稱尖銳。因此，選擇H-Rtx-WAX毛細(xì)管柱分析待測(cè)物。6種化合物色譜圖如圖4所示。

圖4 6種酚類化合物的GC-MS總離子流圖

2.5 線性范圍和檢出限

采用外標(biāo)法定量，按照表1配制酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化條件下上機(jī)分析。以6種酚類化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察方法的線性范圍。所得的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。不同酚類化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 6種酚類化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

選擇低色素含量的白菜和高色素含量的韭菜作為代表，準(zhǔn)確稱取不含待測(cè)6種酚類化合物的空白蔬菜樣品，分別添加0.01，0.10和0.50 mg/kg（其中4-氯-3,5-二甲基苯酚為0.02，0.20和1.00 mg/kg；對(duì)苯二酚為0.05，0.50和2.5 mg/kg）的待測(cè)酚類化合物，其他步驟同1.3小節(jié)，每個(gè)添加水平重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，各農(nóng)藥助劑平均回收率為74.69%～115.23%，δRSD＜8.05%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可滿足蔬菜中酚類化合物殘留檢測(cè)的要求，6種待測(cè)酚類化合物的添加回收率和δRSD見表3。

表3 6種酚類化合物的添加回收率和δRSD（n=6）

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

選取重慶市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)不同的蔬菜樣品作為考察樣品，包括黃瓜、芹菜、韭菜、白菜等不同類型的10個(gè)樣品，應(yīng)用優(yōu)化好的分析方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，1個(gè)黃瓜樣品檢出苯酚殘留，含量為1.78 μg/kg，其余蔬菜樣品未檢出。雖然僅一個(gè)樣品檢出，但是鑒于樣本數(shù)量有限，酚類化合物的殘留亦不容忽視。因此相關(guān)部門應(yīng)該加強(qiáng)農(nóng)藥助劑的管理工作，并重視酚類化合物殘留對(duì)農(nóng)產(chǎn)品造成的污染。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)開發(fā)并驗(yàn)證的固相萃取結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可以準(zhǔn)確高效地檢測(cè)蔬菜中6種酚類化合物殘留。試驗(yàn)證明固相萃取凈化可以減少基質(zhì)的影響，提高提取效率，并對(duì)固相萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法適用于蔬菜中酚類化合物殘留量的測(cè)定及調(diào)查研究，可以為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管提供依據(jù)和技術(shù)支持。