韓子，郭曉東，王元鳳，魏新林*

1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院（上海 200240）；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200234）

蛋白類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、食品及環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。其常用的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）[1]、電化學(xué)[2]、基于熒光的蛋白質(zhì)微陣列[3]等。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法需要消耗大量材料，操作復(fù)雜、產(chǎn)量低，影響在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用[4]。

拉曼散射現(xiàn)象推動(dòng)檢測(cè)技術(shù)的革新，但較弱的拉曼效應(yīng)及低靈敏度阻礙其大規(guī)模發(fā)展；表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技術(shù)的發(fā)現(xiàn)在增強(qiáng)拉曼信號(hào)方面提供了新的解決思路。SERS技術(shù)基于貴金屬的聚集效應(yīng)，將待測(cè)分子吸附在納米級(jí)粗糙金屬表面，使得入射光激發(fā)金屬表面電子產(chǎn)生更強(qiáng)烈的共振，極大地增強(qiáng)了拉曼信號(hào)[5]。隨著研究日益深入，SERS技術(shù)成為小分子、大分子蛋白質(zhì)甚至細(xì)胞生物分子分析必不可少的超靈敏分析工具，它可以通過(guò)分子的拉曼指紋圖譜實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)分子的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)[6]。對(duì)SERS技術(shù)的發(fā)展及原理進(jìn)行概述，對(duì)SERS及其聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，為建立基于SERS的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法提供參考。

1 拉曼散射、表面增強(qiáng)拉曼（SERS）光譜及SERS基底

1928年，拉曼等[7]發(fā)現(xiàn)散射光波長(zhǎng)相對(duì)于入射光發(fā)生改變，該現(xiàn)象因此被命名為“拉曼散射”。由于拉曼散射是入射光子（h）的非彈性散射，能夠因其特征分子振動(dòng)的能量而在頻率上發(fā)生位移（圖1a）；依據(jù)散射后波長(zhǎng)的增加或降低，可分為斯托克斯散射（h1）和反斯托克斯散射（h2）[8]。1974年，F(xiàn)leischmann等[9]發(fā)現(xiàn)粗糙銀電極上吡啶產(chǎn)生的拉曼信號(hào)有所增強(qiáng)的現(xiàn)象，即表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）。其原理圖如圖1（b）所示。SERS效應(yīng)產(chǎn)生的原理被認(rèn)為是由電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)介導(dǎo)的[10]。電磁增強(qiáng)理論認(rèn)為，入射光可以激發(fā)納米金屬表面的電子產(chǎn)生局域表面等離子體共振（LSPR）；而化學(xué)增強(qiáng)（電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)）機(jī)制具有一定的限制性，只適用于能與金屬表面形成化學(xué)鍵的物質(zhì)[11]。材料的尺寸、形狀、顆粒間距及介質(zhì)環(huán)境均會(huì)影響LSPR強(qiáng)度[12]進(jìn)而影響SERS效應(yīng)，因此，選擇合適的SERS基底尤為重要。

圖1 拉曼散射的原理[13]（a）和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）的原理[14]（b）

為擴(kuò)大表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用規(guī)模，該技術(shù)的靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、基底成本和制造的簡(jiǎn)易性等問(wèn)題亟待解決[15]。SERS活性納米的結(jié)構(gòu)由2種類(lèi)型的基質(zhì)組成：基于固體表面的基質(zhì)和基于膠體的基質(zhì)[16]。固相的SERS基底有助于制備高度增強(qiáng)信號(hào)的表面金屬納米結(jié)構(gòu)，如將納米顆粒直接沉積在氨基硅烷涂層表面或利用納米光刻技術(shù)、電子束光刻技術(shù)等制備納米三角陣列或納米球[17]；金或銀的納米顆粒液相體系也是常用的SERS基底，與固態(tài)基底相比表現(xiàn)出了更好的分散均勻性[18]?；趯?duì)固相及液相SERS基底的改進(jìn)將有助于開(kāi)發(fā)檢測(cè)性能更高的SERS技術(shù)。

作為一種強(qiáng)大的分析及成像工具，SERS圖譜可以提供更加豐富的振動(dòng)光譜信息，使其在食品分析、藥物分析、生物醫(yī)學(xué)方面獲得廣泛應(yīng)用[19-25]。根據(jù)檢測(cè)方法的不同，基于SERS的蛋白檢測(cè)可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)是SERS直接檢測(cè)法，另一類(lèi)是基于SERS的聯(lián)用技術(shù)。

2 SERS直接檢測(cè)技術(shù)

直接法是SERS中最簡(jiǎn)單常用的方法，可獲取與等離子體材料直接接觸的目標(biāo)分析物的SERS光譜，同時(shí)能獲取蛋白質(zhì)振動(dòng)光譜中的信息；該種方法靈敏度高，某些情況下甚至可以檢測(cè)到單分子[26]。

通過(guò)SERS檢測(cè)蛋白質(zhì)的策略是基于目標(biāo)蛋白存在條件下貴金屬膠體的化學(xué)或物理聚集，納米簇聚集產(chǎn)生的交互效應(yīng)可以產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，這些以高電場(chǎng)強(qiáng)度聚集的局部區(qū)域被稱(chēng)為“熱點(diǎn)”[27]。貴金屬納米粒子因具備良好的等離子體共振效應(yīng)及易于調(diào)諧的幾何學(xué)性質(zhì)，能夠提供豐富的“熱點(diǎn)”，常被用于基于SERS技術(shù)的檢測(cè)。Chen等[28]開(kāi)發(fā)金納米棒（Au NR）修飾的氧化石墨烯作為底物，以裸露的Au NRS為探針的新型夾心免疫結(jié)構(gòu)為SERS基底，用于腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）的定量檢測(cè)；受到化學(xué)和電磁增強(qiáng)的共同作用，檢測(cè)限可達(dá)3.01 pg/mL。在SERS直接檢測(cè)中，納米粒子的尺寸和拉曼照明波長(zhǎng)能夠影響金納米粒子及納米等離子體團(tuán)簇，因而可以通過(guò)調(diào)整光照波長(zhǎng)及選擇合適的金納米團(tuán)簇模型，防止輻射損耗，進(jìn)一步優(yōu)化SERS對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)[29]。

圖2 SERS直接檢測(cè)技術(shù)示意圖

3 基于SERS的聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)

基于SERS的蛋白質(zhì)直接檢測(cè)方法發(fā)展較為成熟，但仍需要昂貴的試劑和儀器，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要訓(xùn)練有素的操作人員等。隨著SERS發(fā)展，許多傳統(tǒng)的檢測(cè)蛋白質(zhì)類(lèi)的方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫印跡法（MIP），在單獨(dú)使用時(shí)往往操作復(fù)雜、穩(wěn)定性和重復(fù)性不強(qiáng)、干擾因素多、成本高[30]，不適用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品等，當(dāng)與SERS聯(lián)用時(shí)，將會(huì)表現(xiàn)出更好的檢測(cè)能力。同時(shí)，隨著近年來(lái)對(duì)臨場(chǎng)檢測(cè)及快速檢測(cè)的要求，SERS與試紙條及生物芯片的聯(lián)用也成為基于SERS的檢測(cè)蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的新型手段。

3.1 SERS與酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）聯(lián)用

ELISA是一種定量分析方法，通過(guò)酶連接的偶聯(lián)物和酶底物之間相互作用所產(chǎn)生的顏色變化來(lái)表現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)[31]。傳統(tǒng)的ELISA所用抗原及抗體的制備成本高，質(zhì)量易受抗原抗體制備方法的影響[32]，需要較為精密的操作，具有一定的局限性。

通常情況下，檢測(cè)抗體和拉曼報(bào)告分子標(biāo)記在納米粒子表面形成免疫拉曼探針，當(dāng)免疫拉曼探針與抗原結(jié)合時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)拉曼信號(hào)來(lái)確定抗原濃度[33]。由于蛋白質(zhì)是一類(lèi)大分子物質(zhì)，在基于SERS的ELISA檢測(cè)法中，“三明治”模式是最常見(jiàn)的一種（圖3A）。Yang等[34]制備一種新型的等離子體多層核殼的-衛(wèi)星納米結(jié)構(gòu)（Au@Ag@SiO2-AuNPs），Au@Ag作為SERS平臺(tái)，較高的SiO2層在Au@Ag與AuNPs之間表現(xiàn)出遠(yuǎn)程等離子體耦合，進(jìn)一步導(dǎo)致了拉曼散射增強(qiáng)。此外，還可以利用過(guò)氧化氫的還原性來(lái)改變金屬納米顆粒以實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測(cè)。Liang等[33]結(jié)合SERS和銀納米粒子聚集，ELISA的酶標(biāo)物質(zhì)通過(guò)控制過(guò)氧化氫對(duì)拉曼標(biāo)記銀納米顆粒的溶解，實(shí)現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)，同時(shí)，該過(guò)程在分析物存在時(shí)產(chǎn)生較強(qiáng)的拉曼信號(hào)。

3.2 SERS與免疫印跡技術(shù)

分子印跡聚合物（MIP）具有特定的識(shí)別能力，穩(wěn)定性好、制備簡(jiǎn)單、成本低，與SERS聯(lián)用時(shí)不需要特殊的標(biāo)記，因而具備廣泛的應(yīng)用前景。如圖3（B）所示，MIP材料可作為待測(cè)目標(biāo)蛋白的預(yù)濃縮方法，在SERS標(biāo)簽即金屬納米粒子和拉曼信號(hào)分子的作用下，通過(guò)抗體與抗原特異性結(jié)合以獲得SERS信號(hào)[35]。有研究表明，結(jié)合MIP可以捕獲糖蛋白、包括SERS報(bào)告基因的金屬NPs以及硼酸基結(jié)合到蛋白質(zhì)的糖基化部分來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)檢測(cè)[36]。Tu等[37]采用金基硼酸鹽親和分子印跡技術(shù)從復(fù)雜樣品中特異性提取目標(biāo)糖蛋白，金陣列在激光照射下產(chǎn)生等離子體波，顯著增強(qiáng)SERS信號(hào)，分析時(shí)間可以縮短至30 min。MIP方法操作較為復(fù)雜，定量分析不夠精確，通過(guò)與SERS聯(lián)用能夠依靠特征性指紋圖譜獲得更為精確的蛋白質(zhì)定性定量指標(biāo)，有助于進(jìn)一步分析鑒定。

3.3 SERS與試紙條聯(lián)用

試紙條是一種快速簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)手段，但通常僅作為一種定性或半定量測(cè)量的工具，其靈敏度和穩(wěn)定性仍有待提高。功能化的Fe3O4@Au磁性納米顆粒（MNPs）可對(duì)雙重感染生物標(biāo)記物進(jìn)行超靈敏分析，而經(jīng)抗體修飾的Fe3O4@Au MNP能夠作為SERS納米標(biāo)記感染生物標(biāo)記物，組裝在側(cè)向流免疫層析試紙條時(shí)，可實(shí)現(xiàn)血液中目標(biāo)感染生物標(biāo)志物的定量檢測(cè)（如圖3C所示）[38]。Wang等[39]利用Fe3O4@Ag磁標(biāo)簽與雙層拉曼分子和捕獲目標(biāo)病毒的抗體結(jié)合，可對(duì)試紙條上的目標(biāo)病毒進(jìn)行特異性識(shí)別和富集，對(duì)甲型H1N1流感病毒和人腺病毒（HAV）的檢出限可分別達(dá)到50和10 PFU/mL。紙基試紙條結(jié)合SERS同樣可以實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的快速、靈敏定量分析。有研究表明，將具備多個(gè)“熱點(diǎn)”的樹(shù)莓型雙金屬Au@AgNP納米結(jié)構(gòu)組裝在箭頭形試紙條上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的高靈敏度檢測(cè)，且樹(shù)莓型的雙金屬納米粒子SERS性能的靈敏度和穩(wěn)定性均優(yōu)于球形AgNP[40]。引入SERS技術(shù)可極大地提高試紙條的定量檢測(cè)及分析的可靠性和靈敏度，有利于實(shí)現(xiàn)LFIA的痕量蛋白質(zhì)檢測(cè)。

3.4 SERS與生物芯片聯(lián)用

生物傳感器可對(duì)蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，靈敏度較高，選擇性好，適用于現(xiàn)場(chǎng)分析。與生物芯片聯(lián)用SERS基底通常是使用刻蝕工藝將模板圖案轉(zhuǎn)移到人IgG底物上，芯片暴露于等離子體后洗去納米顆粒，將其浸入牛血清白蛋白溶液中，獲得圖案化的蛋白質(zhì)芯片，用于蛋白質(zhì)檢測(cè)時(shí)，將上述芯片浸入標(biāo)記抗原溶液中即可完成檢測(cè)[41]。如圖3（D）所示，一般而言，有序排列的硅納米管（SiNPLs）和等離子體銀納米顆粒（AgNPs）可作為增強(qiáng)SERS信號(hào)的有效基底，適用于不同帶電蛋白質(zhì)甚至特殊的淀粉樣蛋白[42]。然而，對(duì)于SERS與生物芯片聯(lián)用的報(bào)道較少，大部分仍集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

圖3 SERS與ELISA（A）、免疫印跡（B）、試紙條（C）、生物芯片（D）技術(shù)聯(lián)用原理圖

4 結(jié)語(yǔ)及展望

SERS技術(shù)觀(guān)察到的拉曼信號(hào)比傳統(tǒng)的拉曼散射高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，能有效降低使用熒光標(biāo)記產(chǎn)生的光淬滅及干擾現(xiàn)象，并能夠通過(guò)選擇合適的SERS基底實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高對(duì)蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。隨著SERS與越來(lái)越多的技術(shù)聯(lián)用，基于SERS的蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的應(yīng)用范圍逐漸從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域拓寬到環(huán)境檢測(cè)、食品等領(lǐng)域。

然而，仍有許多技術(shù)問(wèn)題亟待解決。SERS技術(shù)應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題是待檢測(cè)的分析物附著的有效“熱點(diǎn)”很少；拉曼基底隨機(jī)分布在SERS基底上，導(dǎo)致SERS信號(hào)的重現(xiàn)性通常不佳；不均勻的SERS活性底物影響SERS定量分析的準(zhǔn)確性；不能同時(shí)檢測(cè)樣品中的多種蛋白質(zhì)；SERS基底通常是一次性的，不利于對(duì)待測(cè)物質(zhì)的反復(fù)捕獲和釋放[43]。

針對(duì)上述問(wèn)題，可將目標(biāo)聚焦于構(gòu)建高密度、均勻分布的“熱點(diǎn)”，實(shí)現(xiàn)“熱點(diǎn)”內(nèi)拉曼分子的有效富集。隨著檢測(cè)技術(shù)的日益完善及更靈敏便捷的檢測(cè)方法不斷發(fā)展，基于SERS的檢測(cè)技術(shù)可在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。