吳穎，王佳其，唐文，井玉林，劉晴，王露

1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院（上海 201418）；2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院（上海 201418）

黃酮類化合物是多以游離態(tài)或糖苷類等形式存在于植物體內(nèi)，含有2-苯基色原酮（flavone）結(jié)構(gòu)的一類天然產(chǎn)物，其主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮類、花色素類等物質(zhì)[1]，具有抑菌消炎、抗氧化及美白等多種功效[2]。黃酮類物質(zhì)的美白作用機(jī)理可能是通過多種途徑進(jìn)行的，如黃酮化合物可作為酪氨酸酶的底物類似物與酶的活性位點結(jié)合，競爭性抑制酪氨酸酶活性，影響黑色素的形成[3]；部分黃酮類化合物通過具有還原性和親水性的酚羥基結(jié)合酪氨酸酶分子上的二價銅離子抑制酶活。此外，黃酮化合物兩個苯環(huán)上的酚羥基很容易被氧化成醌類物質(zhì)，從而清除氧自由基延緩衰老。付小華[4]研究表明甘草黃酮對酪氨酸酶具有較強(qiáng)的抑制作用，與日化行業(yè)中常用的美白劑，如維生素C衍生物、熊果苷、曲酸等相比，甘草黃酮天然安全、毒性更低。付建紅等[5]通過酪氨酸酶抑制動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮對酪氨酸酶的抑制作用是可逆的混合型抑制。由于黃酮類化合物具有美白抗氧化、抑菌等多種功效，且來源天然安全、毒副作用小，進(jìn)而成為天然美白化妝品原料的研究熱點。

蒲公英是一種常見的傳統(tǒng)藥食兩用草本植物，在我國很多地區(qū)均可生長，且價格低廉。文獻(xiàn)報道蒲公英具有抗炎抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、清熱解毒等多種功能[6-7]。蒲公英醇提物中含有20余種黃酮類化合物，其中槲皮素、木犀草素、芹菜素、蘆丁等物質(zhì)含量較高[8]。槲皮素和蘆丁對酪氨酸酶均有很強(qiáng)的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和蘆丁對酪氨酸酶的半抑制濃度分別為49.12和90.00 μmol/L[9-10]。關(guān)于蒲公英黃酮的提取、抗氧化、抗菌抗炎等方面的報道較多，但關(guān)于蒲公英黃酮在抑制酪氨酸酶活性及其抑制機(jī)理方面的研究鮮有報道，該文通過優(yōu)化條件提取蒲公英黃酮，并研究其對酪氨酸酶活性的作用及其抑制機(jī)理等，以期開發(fā)蒲公英黃酮類物質(zhì)在美白等日化產(chǎn)品中應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英（上海人和堂國藥總店）；酪氨酸酶（美國Sigma公司）；L-多巴、熊果苷（上海泰坦科技股份有限公司）；DPPH、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、維生素C（上海寶曼生物科技有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、碳酸鈉、硝酸鋁等試劑（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JP-300B-6D型粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）；TDZ4A-WS型離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 蒲公英黃酮的制備

以料液比、乙醇濃度、提取時間為單因素，優(yōu)化提取蒲公英黃酮的過程為：稱取蒲公英粉末約2 g，按不同料液比（1∶125，1∶100，1∶75和1∶50（g/mL）），加入一定量的乙醇水溶液，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為55%，60%，65%，70%，75%和80%，加熱回流，提取時間分別為90，120，150和180 min，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮后得蒲公英黃酮。優(yōu)化后的最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶75（g/mL）、加熱回流時間為2 h。

1.4 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[11]繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，以體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇水溶液溶解配制質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。取不同體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，補(bǔ)加30%乙醇至5 mL，再分別加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%亞硝酸鈉溶液和0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%硝酸鋁溶液，混勻靜置6 min后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氫氧化鈉溶液，用30%乙醇補(bǔ)至總體積為10 mL，靜置15 min，在505 nm波長下測量體系的吸光度值?？瞻讌⒈葘φ諡?0%乙醇。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=7.25C+0.028 2，R2=0.999。

1.5 酪氨酸酶抑制率的測定

具體操作根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-13]所提供的方法。取1.5 mL pH為6.8的磷酸緩沖液和0.5 mL活度50 U/mL的酪氨酸酶溶液，加入1 mL不同質(zhì)量濃度的蒲公英黃酮，混勻靜置10 min后加1 mL 0.01 mol/L的L-多巴溶液，靜置10 min后在475 nm波長處測量體系的吸光度值。以磷酸緩沖溶液為空白對照，熊果苷作為陽性對照，抑制率計算如式（1）。

式中：ODA為有酪氨酸酶但不含蒲公英黃酮組吸光度；ODB為不含酪氨酸酶和蒲公英黃酮組吸光度；ODC為含有酪氨酸酶和蒲公英黃酮組吸光度；ODD為有蒲公英黃酮但不含酪氨酸酶組吸光度。

1.6 酪氨酸酶抑制機(jī)理及動力學(xué)研究

根據(jù)李倩等[14]的方法，以0.01 mol/L的L-多巴為底物，保持其加入量1 mL，加入不同質(zhì)量濃度（0，0.1，0.4，0.8，1.0和1.2 mg/mL）的蒲公英黃酮溶液，酶添加量分別為0.5，0.7，1.0和1.2 mL，按照1.5中的操作步驟，測定每個質(zhì)量濃度的蒲公英黃酮溶液在不同體積酪氨酸酶下對酪氨酸酶催化氧化L-多巴能力的影響。

保持酪氨酸酶的添加量1 mL，改變底物L(fēng)-多巴的濃度（1，2，4，6，8和10 mmol/L），測定不同質(zhì)量濃度（0，3，4和5 mg/mL）蒲公英提取物對酪氨酸酶活力的影響，以底物L(fēng)-多巴濃度的倒數(shù)（S-1）對酶反應(yīng)速率的倒數(shù)（V-1）作圖，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，根據(jù)米氏方程來判斷蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制作用類型以及相關(guān)動力學(xué)參數(shù)[15]。

1.7 抗氧化活性測定

參考Nasab等[16]的方法，將不同質(zhì)量濃度的蒲公英黃酮溶液與0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液相混合，避光放置40 min，在517 nm波長處測定吸光度值（無水乙醇為空白對照）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活力的抑制率

以最佳提取條件所得蒲公英黃酮的提取率最高為3.47%。楊嵐等[17]對蒲公英花醇提取液中總黃酮含量進(jìn)行測定，其總黃酮含量為3.65%，實驗提取物總黃酮含量與之相當(dāng)，但高于張智等[18]通過復(fù)合酶法提取蒲公英總黃酮含量為1.509%。進(jìn)一步研究蒲公英黃酮對酪氨酸酶酶活的抑制作用，并以熊果苷為陽性對照，結(jié)果如圖1所示。隨蒲公英黃酮和熊果苷質(zhì)量濃度增大，其對酪氨酸酶活性的抑制作用也增強(qiáng)，蒲公英黃酮對酪氨酸酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）約2.5 mg/mL，略優(yōu)于熊果苷對酪氨酸酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）2.97 mg/mL。文獻(xiàn)報道甘草提取物對酪氨酸酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為2.94 mg/mL[19]，甘草提取物是目前美白日化產(chǎn)品中常用的天然美白劑，蒲公英黃酮的美白作用與其相當(dāng)，且蒲公英作為傳統(tǒng)藥食兩用植物，效優(yōu)價廉，安全性極高，因而可作為一種具有良好研發(fā)價值的天然酪氨酸酶抑制劑。

圖1 蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制作用

2.2 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活性的抑制效應(yīng)

以一定濃度的L-多巴為底物，添加不同量的酪氨酸酶，考察不同質(zhì)量濃度的蒲公英黃酮對酪氨酸酶酶活的影響，結(jié)果如圖2所示。酶活力隨酶體積增加逐漸增大，在相同酶量的條件下，隨著蒲公英黃酮質(zhì)量濃度的增大，酶活力逐漸下降。酶活力對酶體積作圖得到一組過原點的直線，且隨著蒲公英黃酮質(zhì)量濃度的增大，直線的斜率逐漸減小，說明黃酮提取物對酪氨酸酶活性的抑制屬于可逆抑制[20]。也就是說蒲公英黃酮通過抑制酪氨酸酶活力實現(xiàn)降低其催化氧化L-多巴的能力，而不是通過減少有效酪氨酸酶的數(shù)量或直接使酶失去活力。

圖2 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活力的抑制機(jī)理

2.3 蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制動力學(xué)

以底物L(fēng)-多巴濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，酪氨酸酶活力反應(yīng)初速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，縱截距代表1/Vm（酶促最大反應(yīng)速率），通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，斜率為Vm/Km（米氏常數(shù)），進(jìn)而判斷蒲公英黃酮對酪氨酸酶活性的抑制類型，實驗結(jié)果如圖3和表1所示。隨著蒲公英黃酮質(zhì)量濃度的增大，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖為一組相交于第三象限的直線，直線斜率逐漸增大，Km、Vm都減小。由文獻(xiàn)可知[21]，直線相交于第三象限、Vm值和Km值都減小，但減小的比例不同，表明蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制類型為混合型抑制。也就是說，蒲公英黃酮作為酪氨酸酶活抑制劑，既可與游離的酶結(jié)合，也可與酶與底物的絡(luò)合物結(jié)合，阻止絡(luò)合物分解為產(chǎn)物而抑制黑色素的生成。以米氏方程的斜率和截距對蒲公英黃酮質(zhì)量濃度作圖（圖3b、3c），分別得到蒲公英黃酮對游離酶的抑制常數(shù)KI為0.021 4 mg/mL，對酶和底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)KIS為1.508 mg/mL。

圖3 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活性抑制作用的雙倒數(shù)曲線

由文獻(xiàn)[22]可知，倒數(shù)1/KI可以代表抑制劑（I）與酶（E）的親和力，1/KIS可以代表抑制劑（I）與酶和底物的復(fù)合物（ES）的親和力。由表1可知，1/KI＞1/KIS，說明蒲公英黃酮與酪氨酸酶的親和力大于蒲公英黃酮與L-DOPA和酪氨酸酶的復(fù)合物的親和力。蒲公英黃酮通過1/KIS、1/KI這兩種親和方式影響酪氨酸酶活性，一方面通過結(jié)合酪氨酸酶活性中心以外的其他基團(tuán)進(jìn)行非競爭型抑制；另一方面還能通過與L-DOPA和酪氨酸酶結(jié)合的復(fù)合物反應(yīng)，進(jìn)行反競爭型抑制，進(jìn)一步說明蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制類型為非競爭型與反競爭型混合的抑制作用。根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]報道，木犀草素是蒲公英黃酮的主要成分之一，其對酪氨酸酶的抑制機(jī)理為非競爭型抑制，抑制常數(shù)KI為86 mmol/L。推測蒲公英黃酮中可能含有某種或某些成分對酪氨酸酶的抑制作用為反競爭型抑制，通過與木犀草素等共同作用，使蒲公英黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制表現(xiàn)為混合型抑制類型。

表1 酪氨酸酶抑制動力學(xué)參數(shù)

2.4 體外抗氧化活性

蒲公英黃酮對DPPH+清除結(jié)果如圖4所示。隨著蒲公英黃酮質(zhì)量濃度增大，清除作用逐漸增大。蒲公英黃酮質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，DPPH+的清除率達(dá)到89.35%，與陽性對照VC的清除率接近，表明蒲公英黃酮具有較好的清除自由基的能力。這與張坤等[25]研究報道的蒲公英總黃酮質(zhì)量濃度為9.6 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達(dá)到80.39%的結(jié)果相近似。此外，蒲公英黃酮與常用的天然抗氧化劑茶多酚相比，也具有較好的抗氧化性能，如文獻(xiàn)[26]報道，綠茶提取物質(zhì)量濃度400 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到60%。酪氨酸酶的抑制機(jī)理可能與抗氧化作用有關(guān)，蒲公英黃酮的抗氧化活性也可能與酪氨酸酶的抑制機(jī)理相關(guān)。

圖4 蒲公英黃酮對DPPH+的清除作用

3 結(jié)論

蒲公英是一種具有多種功效的藥食兩用植物，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇可以有效提取蒲公英黃酮。在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蒲公英黃酮可以有效抑制酪氨酸酶的活性，其半抑制濃度（IC50）約2.5 mg/mL，抑酶活性略高于陽性對照熊果苷。蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制作用表現(xiàn)為可逆的非競爭型與反競爭型結(jié)合的混合型抑制類型，即蒲公英黃酮通過與酶和酶-底物復(fù)合物結(jié)合的方式抑制酶活。由動力學(xué)參數(shù)可知，兩種抑制酶活方式相比，蒲公英黃酮對酶的親和能力更強(qiáng)。此外，蒲公英黃酮具有較好的抗氧化性能，其對酪氨酸酶的抑制作用可能與抗氧化性能有關(guān)。蒲公英是安全性極高的天然產(chǎn)物，且價格低廉、取材廣泛，可深入進(jìn)行研究開發(fā)具有美白、抗氧化等多種功效的蒲公英黃酮及其日化產(chǎn)品。