萬(wàn)宇平 ，吳小勝 ，賈芳芳 ，崔娜 ，馬玉華 ，何方洋

1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司（北京 102206）；2.北京望爾生物技術(shù)有限公司（北京 102206）；3.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心（北京 102206）

多菌靈（carbendazim），化學(xué)名稱為N-（2-苯并吡唑基）氨基甲酸甲酯，屬于苯并吡唑類，是一種病害防治殺菌劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物。然而施用多菌靈的目標(biāo)物會(huì)長(zhǎng)期殘留該藥物，人、畜食用后，會(huì)引起頭暈、惡心、嘔吐、抽搐等一系列中毒癥狀[1-3]。

因此，目前很多國(guó)家都規(guī)定了多菌靈在農(nóng)副產(chǎn)品中的最高殘留限量。GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了果蔬、茶葉中多菌靈的MRL范圍：20～5 000 μg/kg。我國(guó)很多標(biāo)準(zhǔn)采用的均為儀器方法。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于多菌靈的分析方法主要有分光光度法、超高效液相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、拉曼光譜法等[6-12]，以上方法多為儀器方法，缺點(diǎn)是成本高、步驟復(fù)雜，不便于基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)[13-20]。為了方便、快速、低成本地檢測(cè)煙葉中多菌靈殘留[21]，此次試驗(yàn)研發(fā)了一種多菌靈膠體金快速檢測(cè)試紙條，適合基層檢測(cè)部門大批量篩查樣本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多菌靈、噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；牛血清白蛋白、卵清蛋白（分析純，美國(guó)Sigma公司）；三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸銨、氫氧化鈉、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化錫、碳二亞胺、石油醚、硫化銨、二甲基甲酰胺、碳酸鉀（分析純，北京百欣試劑公司）；果蔬、茶葉、煙葉（市售）；多菌靈抗體（本研究平臺(tái)）。

GT-700膠體金分析儀（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多菌靈半抗原的制備

20 mL三氟乙酸加2 mL三氟乙酸酐，冰水浴，降至0 ℃，加0.5 g硝酸銨，攪拌1 h，加入含1.0 g多菌靈的三氟乙酸溶液，繼續(xù)攪拌，反應(yīng)2 h。停止反應(yīng)，就稀氫氧化鈉溶液中和到中性，二氯甲烷萃取，水洗，蒸干，乙醚洗滌結(jié)晶，得到化合物a（0.76 g，收率67%）。1H NMR（CDCl3，300 MHz）δ：8.31（1H，dd，J=1.616，J=1.239），7.69（1H，dd，J=8.716，J=1.616），7.64（1H，dd，J=8.716，J=1.239），3.85（3H，s）。

0.7 g化合物a加乙醇溶解，加10 mL含0.43 g氯化錫水溶液，通入氮?dú)?，加入回流反?yīng)3 h；然后旋蒸、萃取、濃縮，利用體積比1∶1的石油醚-乙酸乙酯對(duì)其進(jìn)行洗脫分離，得到b產(chǎn)物（半抗原化合物，0.54 g，收率83%）。1H NMR（CDCl3，300 MHz）δ：3.79（3H，s），6.27（2H，s），6.90（1H，dd，J=2.225，J=1.850），6.46（1H，dd，J=8.422，J=2.225），7.34（1H，dd，J=8.422，J=1.850），5.00（1H，s），9.15（1H，s）。

圖1 多菌靈半抗原合成

取上述產(chǎn)物，經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，化學(xué)位移δ=6.27的為苯環(huán)上芳香胺的共振吸收峰，該吸收峰的存在證明半抗原合成成功。

1.2.2 免疫原的制備

稱取50 mg牛血清白蛋白，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）中，得到溶液A；用0.2 mL H2O溶解30 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，加入至溶液A中，攪拌30 min；取15 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，然后緩慢加入到蛋白中溶解，攪拌24 h。透析后分裝，于-20 ℃保存。

1.2.3 包被原的制備

稱取50 mg卵清蛋白，使之充分溶解在3.8 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）中，得到溶液B；用0.2 mL H2O溶解30 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，加入至溶液B中，攪拌30 min；取13 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，然后緩慢加入到蛋白中溶解，攪拌24 h。透析后分裝，于-20℃保存。

1.2.4 多菌靈單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至7.0，每毫升膠體金溶液加入30 μg多菌靈單克隆抗體，攪拌后加入10% BSA，靜置、離心，將沉淀重懸，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 樣本前處理方法

1) 干煙葉：稱取1.0 g粉碎的樣本至50 mL離心管中；鮮煙葉：稱取2.0 g粉碎的樣本至50 mL離心管中。

2) 加入10 mL 50%甲醇，充分混勻。

3) 使用濾膜進(jìn)行過濾，稀釋后使用。

1.2.6 檢測(cè)方法

每個(gè)加樣孔中加入100 μL待檢液，反應(yīng)10 min，判讀結(jié)果。陰性（-）：T線顯色比C線顯色深或顯色一致，均表示樣本中無(wú)多菌靈藥物或多菌靈藥物濃度低于檢測(cè)限。陽(yáng)性（+）：T線顯色比C線顯色淺或T線不顯色，表示樣本中多菌靈藥物濃度等于或高于檢測(cè)限。無(wú)效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已失效。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙條重新測(cè)試。

圖2 多菌靈膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖

1.2.7 試紙條的最低檢出限

樣本中添加多菌靈，空白干煙葉樣本的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0，1 000，2 000，3 000和4 000 μg/kg，空白鮮煙葉樣本的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0，200，250，300和350 μg/kg，按照1.2.6所述方法，用3批不同時(shí)間制備的試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)5次，以此確定試紙條的最低檢出限（Limit of detection，LOD）。

1.2.8 試紙條的特異性

殺菌劑種類較多，經(jīng)常會(huì)合用，試驗(yàn)選取了4種應(yīng)用廣泛的殺菌劑，并分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1 000 μg/kg的噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑等藥物，判斷試紙條的特異性。

1.2.9 試紙條的準(zhǔn)確性

總局辦公廳關(guān)于印發(fā)食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范的通知（食藥監(jiān)辦科[2017]43號(hào)）：以假陽(yáng)性率和假陰性率評(píng)價(jià)膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取50份已確證的空白干煙葉、鮮煙葉樣品，用該試紙條檢測(cè)多菌靈藥物殘留，計(jì)算假陽(yáng)性率；取50份已確證的多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 000 μg/kg的陽(yáng)性干煙葉樣品以及300 μg/kg的鮮煙葉樣品，用該試紙條檢測(cè)多菌靈藥物殘留，計(jì)算假陰性率?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求試紙條假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零。

1.2.10 試紙條的穩(wěn)定性

根據(jù)上述方法研制出的試紙條存放于2～8 ℃，每月固定日期測(cè)定空白干煙葉樣品、添加多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 000 μg/kg的陽(yáng)性干煙葉樣品各10份，以及空白鮮煙葉樣品、添加多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 μg/kg的陽(yáng)性鮮煙葉樣品各10份，重復(fù)測(cè)定2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的鑒定

制備好的膠體金溶液呈酒紅色，均勻、透明、無(wú)雜質(zhì)；將其置于透射電鏡下觀察。由圖3可知，所測(cè)定的膠體金粒徑在20 nm左右。

圖3 膠體金電鏡掃描結(jié)果（×100 000）

2.2 最低檢出限

用試紙條檢測(cè)干煙葉樣品（多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0，1 000，2 000，3 000和4 000 μg/kg）和鮮煙葉樣品（多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0，200，250，300和350 μg/kg），按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)限。以只出現(xiàn)質(zhì)控線時(shí)的最低標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為試紙條的檢測(cè)限，依此為衡量標(biāo)準(zhǔn)，該試紙條對(duì)干煙葉的檢測(cè)限為2 000 μg/kg，對(duì)鮮煙葉的檢測(cè)限為300 μg/kg，結(jié)果見表1。

表1 多菌靈快速檢測(cè)試紙條對(duì)樣品的最低檢出限

2.3 特異性

通過該試紙條檢測(cè)1 000 μg/kg的噻苯達(dá)唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑等藥物，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，即與其他藥物無(wú)交叉反應(yīng)，該試紙條特異性較好。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 準(zhǔn)確性

準(zhǔn)確性通過測(cè)定試紙條的假陽(yáng)性率和假陰性率來(lái)評(píng)價(jià)。由圖5（A）（由于圖片過多，圖5僅為部分結(jié)果）可知，試紙條的假陽(yáng)性率低于5%；由圖5（B）可知，試紙條的假陰性率為0，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。

圖5 假陽(yáng)性（A）及假陰性（B）試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性

干煙葉檢測(cè)結(jié)果見圖6（由于圖片過多，圖6僅為部分結(jié)果）。12個(gè)月內(nèi)，試紙條的假陽(yáng)性率和假陰性率均符合要求，即試紙條在2～8 ℃下能夠保存12個(gè)月。

圖6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

1) 通過檢索文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多菌靈殘留量的快速檢測(cè)方法主要集中在儀器方法，快速檢測(cè)方法非常少，尚未檢索到能夠同時(shí)檢測(cè)干煙葉、鮮煙葉中多菌靈的膠體金試紙等快速檢測(cè)方法的報(bào)道。此次研究的多菌靈膠體金試紙條操作簡(jiǎn)便，無(wú)需設(shè)備，具有實(shí)用性，對(duì)比儀器方法來(lái)說，更加友好[21]。然而，GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了多菌靈對(duì)6種谷物、4種油料油脂、16種蔬菜、28種水果等幾十種食品類別的最大殘留限量，由于本平臺(tái)偏重實(shí)際應(yīng)用，因此此次研究樣本較少，今后可根據(jù)市場(chǎng)需求，結(jié)合該國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本拓展。

2) 多菌靈原料藥經(jīng)硝化反應(yīng)，在苯環(huán)上引入硝基，經(jīng)還原后得到帶有芳香胺的半抗原產(chǎn)物。由此制備的半抗原進(jìn)而制備成免疫原和包被原，制備方法均不繁瑣，便于進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。