王六強(qiáng)，張新武，孔紅建，王楊，張嬌嬌

河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，鄭州市抗消化淀粉生產(chǎn)技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（鄭州 450053）

淀粉是自然界中非常富裕的能量資源，特別是在人們生活中有著重要作用和需求。長(zhǎng)期以來(lái)，淀粉被認(rèn)為可以被人體完全消化和吸收，然而，20世紀(jì)80年代，英國(guó)生理學(xué)家Flan Englystt在研究中發(fā)現(xiàn)在被包埋的不溶性膳食纖維中含有淀粉成分，并稱之為Resistant starch，簡(jiǎn)稱RS，即抗性淀粉。在隨后的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從加工食品中分離出的某些常見(jiàn)的淀粉，無(wú)法在人工模擬消化環(huán)境中被淀粉酶水解，至此，抗性淀粉的研究引起國(guó)外學(xué)者的關(guān)注。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）1990年的定義，抗性淀粉指的是“健康者小腸中不吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物”，但能在大腸中發(fā)酵的淀粉及其淀粉降解物的總稱[1]?？剐缘矸鄣幕瘜W(xué)性質(zhì)還沒(méi)有較為明確的分類(lèi)，但根據(jù)淀粉的來(lái)源和試驗(yàn)性質(zhì)分析，可將其分4個(gè)類(lèi)別，分別為RS1（物理包埋淀粉）、RS2（抗性淀粉顆粒）、RS3（老化淀粉）、RS4（化學(xué)改性淀粉）[2]。

在食品加工中，抗性淀粉具有特殊的生理功能和特性，可作為食品加工輔助產(chǎn)品，適合用于制造高品質(zhì)食品，在生物行業(yè)、醫(yī)學(xué)行業(yè)、食品加工行業(yè)引起廣泛關(guān)注[3]。如食品加工中，在低水分的食品中添加普通的膳食纖維，會(huì)使得食品的口感、品質(zhì)下降，而抗性淀粉的作用與膳食纖維類(lèi)似，但又比膳食纖維具有更出色的生理功能，不但不影響食品的口感和品質(zhì)，還能使食品的口感更佳酥脆，使食品具有更加出色的蓬松性[4]。在醫(yī)學(xué)行業(yè)，抗性淀粉被食用后，可以直接進(jìn)入人體的小腸里分解，產(chǎn)生大量脂肪酸，對(duì)保持腸道健康和預(yù)防一些血糖疾病等有重要作用[5-6]。人體健康與碳水化合物的關(guān)系密不可分，因此抗性淀粉具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。

抗性淀粉的制備主要分為物理法、化學(xué)法和酶法改性3種。其中，物理法、化學(xué)法具有不同程度的缺點(diǎn)。如化學(xué)法中主要采用酸水解法，其脫支作用專一性差，并且酸堿試劑在后續(xù)產(chǎn)品處理中更加麻煩，存在一定污染問(wèn)題[7]。酶法脫支可分為均相脫支和異相脫支，前者是淀粉在高溫糊化后加入酶，降溫脫支處理；后者是不經(jīng)過(guò)糊化的淀粉，在較低溫度下進(jìn)行部分脫支處理[8]。普魯蘭酶可在水解過(guò)程中切斷支鏈淀粉中的α-1, 6糖苷鍵，是水解產(chǎn)物中含有更多的直鏈分子，耐高溫α-淀粉酶可以適當(dāng)?shù)厍卸谭肿渔?，將這2種酶結(jié)合使用，可使長(zhǎng)度均勻且長(zhǎng)度適中的直鏈淀粉在相互重新排列形成抗性淀粉時(shí)效率更高，最終得率得到極大提升[9]。與物理化學(xué)方法相比，酶法脫支具有能耗少、成本低、效率高、更加綠色無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，制備食品更加安全衛(wèi)生，因此受到廣泛關(guān)注。

試驗(yàn)以新鮮馬鈴薯為原料，以抗性淀粉得率為考察目標(biāo)，研究耐高溫α-淀粉酶用量和作用時(shí)間，以及普魯蘭酶用量、作用時(shí)間、作用溫度等多種因素對(duì)抗性淀粉制備得率影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上后，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)分析最佳工藝條件，以期提高抗性淀粉得率[10]。試驗(yàn)為抗性淀粉的制備和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮馬鈴薯（市售）；耐高溫α-淀粉酶、普魯蘭酶（諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司）；胃蛋白酶溶液、葡萄糖淀粉酶（河南仰韶生化工程有限公司）；抗性淀粉檢測(cè)試劑盒（愛(ài)爾蘭Megazyme公司）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100A型立式壓力滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；TDZ5-WS臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；SHA-C型恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）；DHGT-9053A型鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；723N型分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；HR1844型破碎機(jī)（珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬鈴薯抗性淀粉制備工藝

馬鈴薯抗性淀粉的制備方法參考李珊珊等[12]方法，并加以改良。

1.3.2 抗性淀粉含量測(cè)定方法

抗性淀粉檢測(cè)操作采用AOAC-GOPOD法[13]。準(zhǔn)確稱取100 mg樣品，加入4.0 mLα-胰淀粉酶，于37 ℃振蕩16 h，加入4.0 mL無(wú)水乙醇，離心10 min，收集上清液，沉淀用50%乙醇洗滌3次，合并上清液，沉淀水浴，加入2 mL 2 mol/L的KOH，磁力攪拌，加入8 mL 1.2 mol/L的醋酸鈉緩沖溶液，混勻，加入0.1 mL AMG，于50 ℃水浴30 min。RS含量＜10%時(shí)，將處理后溶液直接離心；RS含量＞10%時(shí)，根據(jù)抗性淀粉的含量定容溶液，取少量溶液離心。用GOPOD法測(cè)定還原糖的含量。抗性淀粉含量為還原糖含量×0.9。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)在耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g、作用時(shí)間30 min；普魯蘭酶用量5 NPUN/g、作用時(shí)間8 h、作用溫度60 ℃基礎(chǔ)上，變換相應(yīng)因素水平：耐高溫α-淀粉酶用量（1，3，5，7和9 NU/g）；耐高溫α-淀粉酶作用時(shí)間（10，20，30，40和50 min）；普魯蘭酶用量（2，4，6，8和10 NPUN/g）；普魯蘭酶作用時(shí)間（2，6，10，14和18 h）；普魯蘭酶作用溫度（50，55，60，65和70 ℃），按照抗性淀粉的制備方法，考察不同因素對(duì)抗性淀粉得率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行五因素四水平的正交試驗(yàn)分析，選取的5個(gè)因素，分別為耐高溫α-淀粉酶用量和作用時(shí)間，以及普魯蘭酶用量、作用時(shí)間、作用溫度。設(shè)計(jì)水平安排見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)方案設(shè)定

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.1.1 耐高溫α-淀粉酶用量對(duì)抗性淀粉得率的影響

由圖1所示，在單因素試驗(yàn)中，耐高溫α-淀粉酶用量較少時(shí)，抗性淀粉得率受到較大影響，耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g時(shí)，得率達(dá)到最高，為10.1%，而超過(guò)3 NU/g時(shí)，得率又略有下降。分析認(rèn)為，酶量的多少?zèng)Q定了切割淀粉的程度，酶量大時(shí)，直鏈分子被酶切太短，不利于分子間重新結(jié)合形成所需淀粉分子，酶量過(guò)小時(shí)，直鏈分子酶切不夠完全，達(dá)不到較好的切割效果，同樣不利于抗性淀粉形成。

圖1 耐高溫α-淀粉酶用量對(duì)抗性淀粉得率的影響

2.1.2 耐高溫α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響

由圖2所示，在單因素試驗(yàn)中，隨著耐高溫α-淀粉酶作用時(shí)間增加，抗性淀粉得率先增大后減小，耐高溫α-淀粉酶作用時(shí)間30 min時(shí)，抗性淀粉得率達(dá)到最高，為10.08%。分析認(rèn)為，耐高溫α-淀粉酶切割淀粉分子需要一定作用時(shí)間，時(shí)間過(guò)短，淀粉分子水解程度不夠，切割成的分子鏈過(guò)長(zhǎng)，不易形成抗性淀粉，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)將分子鏈切得太短，使得分子運(yùn)動(dòng)過(guò)快，也不利于形成抗性淀粉。

圖2 耐高溫α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響

2.1.3 普魯蘭酶用量對(duì)抗性淀粉得率的影響

由圖3所示，在單因素試驗(yàn)中，普魯蘭酶用量對(duì)抗性淀粉的得率存在一定程度的影響。普魯蘭酶用量少于4 NPUN/g，隨著用量增大，抗性淀粉得率明顯增大，而之后抗性淀粉得率逐漸下降。普魯蘭酶用量4 NPUN/g時(shí)，抗性淀粉得率為10.02%。分析認(rèn)為，普魯蘭酶對(duì)抗性淀粉的最佳脫支效果存在一定上限?？剐缘矸鄣拿撝Ч堰_(dá)到要求，繼續(xù)進(jìn)行脫支酶解，直鏈分子再次被切割為更小的淀粉分子，分子聚合度過(guò)低，不利于重新結(jié)晶形成抗性淀粉。

圖3 普魯蘭酶用量對(duì)抗性淀粉得率的影響

2.1.4 普魯蘭酶作用時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響

由圖4所示，在單因素試驗(yàn)中，普魯蘭酶作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，均會(huì)使抗性淀粉的得率降低，作用時(shí)間10 h左右時(shí)，抗性淀粉得率達(dá)到最高，為9.82%。分析認(rèn)為酶作用需要一定時(shí)間，作用時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)使酶切割更多分子，從而影響抗性淀粉形成。

圖4 普魯蘭酶作用時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響

2.1.5 普魯蘭酶作用溫度對(duì)抗性淀粉得率的影響

由圖5所示，普魯蘭酶作用溫度55 ℃左右時(shí)，抗性淀粉的得率達(dá)到最高，為10.24%，且作用溫度升高或降低均對(duì)得率均存在較大影響。分析認(rèn)為，酶的活性受到溫度的影響較大：溫度低，則酶的活力不足，不能充分水解支鏈上的α-1, 6-糖苷鍵；溫度過(guò)高，部分酶失去活性，也不利于抗性淀粉形成，只有在酶最佳作用溫度下，可以達(dá)到最好脫支效果。

圖5 普魯蘭酶作用溫度對(duì)抗性淀粉得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

通過(guò)表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，最優(yōu)水平組合為A2B3C2D3E2，即耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g、作用時(shí)間30 min；普魯蘭酶用量4 NPUN/g、作用時(shí)間10 h，作用溫度55 ℃。在此條件下制備抗性淀粉，通過(guò)3組平行試驗(yàn)，由表3可知，抗性淀粉得率為10.45%±0.03%，比較正交試驗(yàn)其他組合，則最優(yōu)組合得率最高。通過(guò)極差分析可知，各因素對(duì)抗性淀粉制備條件影響大小為耐高溫α-淀粉酶用量＞普魯蘭酶作用時(shí)間＞普魯蘭酶作用溫度＞耐高溫α-淀粉酶作用溫度＞普魯蘭酶用量。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 單位：%

分析認(rèn)為，耐高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶分別屬于內(nèi)切酶和異淀粉酶，主要起切割糖苷鍵作用。支鏈淀粉中的α-1, 6糖苷鍵被切開(kāi)，有利于得到更多的直鏈分子；同時(shí)，α-1, 4糖苷鍵的斷開(kāi)，使直鏈淀粉長(zhǎng)度更加平均，有利于分子間的重新排列形成抗性淀粉，使其產(chǎn)率得到極大提高。由抗性淀粉制備原理可知，抗性淀粉主要是由于直鏈淀粉凝沉作用產(chǎn)生的，直鏈淀粉的含量對(duì)抗性淀粉的形成有顯著影響，因此，直鏈淀粉分子含量越高，越有利于淀粉分子相互結(jié)合形成抗性淀粉。耐高溫α-淀粉酶的作用可以適當(dāng)?shù)厍卸谭肿渔?，產(chǎn)生長(zhǎng)度均勻適中的淀粉分子鏈，普魯蘭酶的作用可以切割α-1, 6葡萄糖苷鍵，從而在淀粉水解時(shí)產(chǎn)生更多的直鏈淀粉，有利于分子重新凝結(jié)。因此耐高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶聯(lián)合作用，直接影響到抗性淀粉形成。通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出抗性淀粉得率的最佳條件，通過(guò)結(jié)果對(duì)比可以看出，耐高溫α-淀粉酶用量是其中最重要的影響因素[14]。

3 結(jié)論與討論

針對(duì)不同種類(lèi)的抗性淀粉，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采取多種方法制備，在英國(guó)和美國(guó)有相應(yīng)的抗性淀粉產(chǎn)品進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，但新技術(shù)創(chuàng)新較少，且大多數(shù)研究應(yīng)用基于非顆粒性RS3，其他種類(lèi)的商品化生產(chǎn)和應(yīng)用較少。國(guó)內(nèi)食品行業(yè)對(duì)于抗性淀粉的研究相對(duì)較少，起步較晚，有較大的研究發(fā)展空間[15]。

酶法脫支是一種制備抗性淀粉的有效方法，對(duì)淀粉性質(zhì)產(chǎn)生不同作用。通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)制備抗性淀粉工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝條件：耐高溫α-淀粉酶用量3 NU/g、作用時(shí)間30 min；普魯蘭酶用量4 NPUN/g、作用時(shí)間10 h、作用溫度55 ℃。在此條件下，抗性淀粉得率為10.45%±0.03%。其中，耐高溫α-淀粉酶用量是抗性淀粉形成的重要條件，在最佳條件下，抗性淀粉得率顯著增加。試驗(yàn)為國(guó)內(nèi)抗性淀粉加工技術(shù)和工藝優(yōu)化提供參考。

21世紀(jì)以來(lái)生活水平得到極大提高，飲食更佳豐富美味，但隨之而來(lái)的糖尿病、高血壓、高脂肪等現(xiàn)代病逐漸困擾越來(lái)越多的人群，健康觀念得到普遍重視。因此，開(kāi)發(fā)推廣健康、綠色安全的新型食品，對(duì)健康飲食具有重大意義?？剐缘矸蹚浹a(bǔ)普通膳食纖維的缺點(diǎn)，在功能性食品的生產(chǎn)和應(yīng)用中有重要研究?jī)r(jià)值和廣闊發(fā)展前景，特別是對(duì)健康生活具有重要作用[16]。