馮斌，王君鵬，周盼盼，史繼祖

1.北京科技大學天津?qū)W院（天津 301830）；2.吉林體育學院國家體育總局耐力項目重點實驗室（長春 130022）

山藥（Dioscorea oppositeThunb.）屬于植物薯蕷的塊莖，可食藥兩用，在中國主要產(chǎn)自遼寧、內(nèi)蒙、安徽、山東、河南和江西等地[1-3]。在醫(yī)學中山藥被認為具有補脾養(yǎng)胃、生津益肺等功效[4]。研究表明山藥含有多糖、皂苷、多酚、甾醇等多種生物活性物質(zhì)，具有降血糖、增強免疫力、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老和抗氧化等功能，其中山藥多糖被認為是最重要的活性成分之一，山藥多糖在醫(yī)藥和保健領(lǐng)域擁有良好的應用前景[5-8]。

山藥多糖一般的提取方法為水提醇沉法，近年來，開發(fā)出很多新的提取山藥多糖的方法，如微波提取法、酶劑提取法和超聲波提取法等[9-15]。山藥多糖結(jié)構(gòu)較復雜，多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，采用不同提取方法均可能會引起多糖獲得率、成分及生物活性的變化[5]。然而有關(guān)提取方法對鐵棍山藥多糖抗氧化活性影響的報道不多[5]，這在一定程度上制約山藥活性多糖的應用。以鐵棍山藥為研究對象，選用水提醇沉法、微波法、超聲波法、酶法及微波-酶法分別提取山藥多糖并考察不同提取方法獲得多糖的抗氧化性能，不同提取方法的最佳工藝由實驗室前期篩選獲得。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥（購于中藥材市場）；羥基自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒（某生物科技有限公司）；無水乙醇、葡萄糖等（分析純，天津市某化學試劑有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）；纖維素酶、α-淀粉酶（江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機；勻漿機；電子天平；水浴鍋；722S分光光度儀；干燥箱；PJ23C-SC1美的微波爐；Pilot2-4LD冷凍干燥機；H1850離心機；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 方法

1.3.1 鐵棍山藥多糖的提取工藝流程

挑選山藥外形完整鐵棍山藥，先用清水沖洗表面，去除外皮后，將山藥切成約2 mm的薄片，為防止山藥褐變，可用0.1%檸檬酸和0.02% VC溶液進行護色處理30 min。將護色后的山藥進行冷凍處理，研磨成粉，過0.180 mm孔徑篩備用。在前期工作基礎(chǔ)上，采用各提取方法的最優(yōu)工藝來提取山藥多糖，其工藝流程如下所示。

1）水提醇沉法：料液比1∶9（g/mL）、提取溫度80 ℃、提取時間240 min。2）微波輔助提取法：微波功率650 W、微波時間60 min、料液比1∶12（g/mL）。3）超聲輔助提取法：料液比1∶28（g/mL）、超聲功率600 W，超聲時間90 min、超聲溫度75 ℃。4）微波-酶劑協(xié)同提取法：料液比1∶6（g/mL）、微波功率830 W、提取溫度85 ℃、提取時間150 min，酶劑為α-淀粉酶與纖維素酶，酶量0.5 g淀粉和0.05 g纖維素（50 g山藥粉末）。5）纖維素酶提取法：酶添加量3%、酶解時間75 min、酶解溫度60 ℃、料水比1∶30（g/mL）、0.05 g纖維素（50 g山藥粉末）。

取50 g山藥粉，分別按照水提法、超聲波、微波、纖維素酶和微波-酶法的工藝進行多糖提取。以水提醇沉法為例，按照1∶9（g/mL）料液比混合后，在80 ℃恒溫水浴鍋中水浴240 min后，在離心機中以8 000 r/min離心15 min后，棄去上清液。將沉淀物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，向其中加入80%乙醇進行24 h醇沉，最后離心取沉淀部分進行干燥處理，即可得到山藥多糖。鐵棍山藥多糖得率按式（1）計算。

式中：C為提取液中多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；m為鐵棍山藥粉質(zhì)量，g。

1.3.2 鐵棍山藥多糖濃度的測定

使用苯酚-硫酸法測定山藥多糖的含量。制備0.1 mg/mL葡萄糖溶液，按照表1分別添加葡萄糖溶液并用蒸餾水定容至2 mL，CK管用于對照調(diào)零。在490 nm處測定各管的吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線y=5.79x-0.021，R2=0.997。

表1 試劑添加量

1.3.3 鐵棍山藥多糖的抗氧化能力

通過對所提取的鐵棍山藥多糖進行DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子清除能力的測定[5,16]，得出不同提取方法對鐵棍山藥多糖抗氧化能力的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種提取方法所獲得的山藥多糖得率

分別采用5種不同的提取工藝進行提取，平行3次，取平均值。5種方法所提取的山藥多糖得率如表2和圖1所示。相比于水提醇沉法，微波法、超聲波法、微波輔助酶法及纖維素酶法均顯著提高山藥多糖得率，且縮短提取所用時間，表明在提取鐵棍山藥多糖過程中，破壁是關(guān)鍵。微波-酶劑協(xié)同提取法的提取效果最佳，鐵棍山藥多糖得率為13.83%，相比水提醇沉法提高83.42%，提取的時間也相應縮短90 min。與微波輔助提取法（9.30%）和超聲波輔助提取法（8.57%）相比，纖維素酶提取法的多糖得率（11.55%）較高，說明酶劑裂解細胞壁的效率要高于機械式破壁。山藥多糖主要儲存在細胞內(nèi)，細胞壁的主要成分為纖維素和果膠等，因此添加單一的酶制劑如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶，或者添加復合酶制劑等均能有效促進細胞壁的裂解，從而有利于多糖釋放[14]。微波輔助酶提取法的優(yōu)點是高效，多糖得率達13.83%，其原理是在酶制劑裂解細胞壁基礎(chǔ)上，外加微波能使山藥細胞內(nèi)部的水分等極性物質(zhì)迅速產(chǎn)生大量熱量，產(chǎn)生壓力致使細胞破裂，加速多糖成分的溶出、提取[17-18]。

圖1 不同提取方法對山藥多糖得率的影響

表2 不同提取方法對山藥多糖得率的影響

與水提醇沉法相比，微波和超聲波輔助法能不同程度地提高多糖得率，但超聲波和微波的能量有可能會導致多糖降解，破壞多糖結(jié)構(gòu)，繼而會影響山藥多糖生物活性[5]。酶法提取過程較溫和，但酶劑的使用類別和劑量需要多次篩選，避免不必要的浪費。

2.2 鐵棍山藥多糖雜質(zhì)成分的去除

鐵棍山藥粗多糖的雜質(zhì)成分主要為蛋白類和酚類物質(zhì)等。為避免多糖雜質(zhì)成分對后續(xù)試驗的影響，利用Sevag法去除山藥粗多糖中蛋白類雜質(zhì)，經(jīng)8次反復除雜后，通過紫外光譜掃描，確保在波長260和280 nm處無吸收峰，說明鐵棍山藥多糖無蛋白類雜質(zhì)。酚類雜質(zhì)的去除以Folin-Ciocalteu試劑檢測為準，試劑檢測結(jié)果呈現(xiàn)陰性時，表明山藥多糖中的無酚類雜質(zhì)已被去除[4-5]。

2.3 5種提取方法所得山藥多糖的抗氧化活性比較

2.3.1 鐵棍山藥多糖清除DPPH自由基的能力

不同方法提取的山藥多糖對DPPH自由基清除的結(jié)果如圖2所示，其量效關(guān)系的相關(guān)性較好，均呈現(xiàn)隨著鐵棍山藥多糖濃度增加而表現(xiàn)出更強的清除活性。多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，水提醇沉法、微波輔助法、超聲輔助法、微波輔助酶法及纖維素酶法的DPPH自由基的清除能力分別為69.32%，83.11%，82.43%，94.51%和88.21%。纖維素酶和微波輔助酶提取的多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，其DPPH自由基的清除能力可達92%以上。

圖2 不同提取方法所得鐵棍山藥多糖的DPPH自由基清除能力

2.3.2 鐵棍山藥多糖清除·OH的能力

山藥多糖分子末端的半縮醛羥基能還原自由基。由圖3可知，微波-酶劑協(xié)同法提取的多糖具有最強的清除羥基自由基能力，而超聲波輔助法提取的多糖呈現(xiàn)最弱的清除能力。在鐵棍山藥多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，水提醇沉法、微波輔助法、超聲輔助法、微波輔助酶法及纖維素酶法的·OH清除能力分別為65.01%，75.04%，53.38%，88.56%和87.83%。多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，纖維素酶和微波輔助酶提取的多糖對羥基自由基的清除能力約95%。

圖3 不同提取方法所得山藥多糖的羥基清除能力

2.3.3 鐵棍山藥多糖清除超氧陰離子的能力

由圖4可知，O2-·清除能力隨鐵罐山藥多糖濃度提呈現(xiàn)上升趨勢。山藥多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，水提醇沉法、微波輔助法、超聲輔助法、微波輔助酶法及纖維素酶法的超氧陰離子的清除能力分別為68.32%，81.21%，59.87%，85.54%和80.67%。多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，纖維素酶和微波-酶劑協(xié)同提取法的多糖對O2-·清除能力分別為90.56%和93.43%。其中，微波法、纖維素酶法和微波輔助酶法清除O2-·能力無顯著差異（p＞0.05）。

圖4 不同提取方法所得山藥多糖的超氧陰離子清除能力

3 結(jié)果

采用5種方法提取鐵棍山藥的多糖，其多糖得率由大到小的工藝方法為：微波-酶劑協(xié)同提取法＞纖維素酶提取法＞微波輔助提取法＞超聲波輔助提取法＞水提醇沉法，其中微波-酶劑協(xié)同提取法獲得的多糖得率13.83%，纖維素酶提取法獲得的多糖得率11.55%，微波輔助提取法獲得的多糖得率9.30%，超聲輔助提取法獲得的多糖得率為8.57%和水提醇沉法獲得的多糖得率為7.54%。對5種方法提取的山藥多糖的抗氧化性進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同方法獲得的山藥多糖均具有較高抗氧化活性。其中，由微波-酶劑協(xié)同提取法獲得的多糖具與最強的清除DPPH·、·OH和O2-·能力，多糖濃度3 mg/mL時，清除率分別為DPPH·（96.45%）、·OH（95.32%）和O2-·（93.43%）。

4 結(jié)論

微波法和微波-酶劑協(xié)同提取法獲得的多糖，其二者間的抗氧化性能力無顯著差異（p＞0.05）。超聲波提取的多糖清除·OH和O2-·的能力不及水提醇沉法獲得的多糖，可能是因為在多糖的提取過程中超聲波會破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，影響多糖生物活性。微波-酶劑協(xié)同提取多糖的抗氧化活性大于微波法，是因為淀粉酶和纖維素酶能較溫和地裂解山藥細胞壁，有利于多糖溶出；微波-酶劑協(xié)同提取法和酶法獲得多糖的抗氧化活性無顯著差異，表明微波雖然能提高多糖的提取量，但其在一定程度上可能會影響山藥多糖的生物活性。總體而言，采用酶劑提取多糖，條件較為溫和，且能完整保持多糖生物結(jié)構(gòu)，使多糖具有更高效生物活性。除此以外，采用酶法提取時間較短，且所用設(shè)備簡單，得率（11.0%以上）也較高。常用的酶制劑有淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等，后期試驗可針對不同品種的山藥，篩選出不同劑量和類別，以期為山藥多糖抗氧化活性的應用提供依據(jù)。