張海燕，康三江，張芳，張霽紅，宋娟

1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所（蘭州 730070）；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心（蘭州 730070）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人來食用的酵素產(chǎn)品[1-2]。其在含有植物本身的多種維生素、酶和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的同時，還通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生新的次生代謝物及活性成分，與直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有機小分子更為濃縮，而且更容易為人體所吸收，這正是酵素的魅力所在，也是研究熱點。大量研究表明，這些物質(zhì)從細胞層面調(diào)節(jié)機體的生命活動，具有抗氧化[3-5]、降血脂及減肥[6-7]、提高免疫力[8-9]、解酒與護肝[10]、抑菌[11]、改善腸胃功能[12-13]等功效。但是，由于目前許多酵素的生產(chǎn)工藝不規(guī)范，發(fā)酵過程控制不科學(xué)，使得產(chǎn)品的代謝通路以及代謝終產(chǎn)物難以確定，同時各類酵素產(chǎn)品成分復(fù)雜，作用機理尚不明確。因此，食用酵素的生產(chǎn)工藝以及產(chǎn)品質(zhì)量控制都有待進一步的發(fā)展與研究。

蘋果因其優(yōu)良的感官特性和糖類、蛋白質(zhì)、有機酸、維生素及蘋果多酚等豐富的營養(yǎng)成分而成為全球最受歡迎的水果之一[14]，具有抗氧化、延緩衰老和增強免疫力等功效[15]。目前，蘋果對健康的影響主要歸因于其酚類化合物含量高，酚類物質(zhì)在抑制腫瘤、防止冠心病等方面具有很高的生理活性[16]。自然發(fā)酵體系是酵素食品開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)和微生物多樣性研究的重要來源[17]，該技術(shù)作為酵素產(chǎn)品制作工藝的重要環(huán)節(jié)之一，可產(chǎn)生多種酶、短鏈脂肪酸、醇、酯等次級代謝產(chǎn)物，亦可能將原料的某些成分轉(zhuǎn)化成高活性物質(zhì)，因而產(chǎn)品的風(fēng)味比較特殊[18]。李飛等[19]和楊小幸等[20]研究了天然發(fā)酵過程中蘋果酵素的抗氧化活性和代謝產(chǎn)物的變化，但有關(guān)發(fā)酵條件對自然發(fā)酵蘋果酵素品質(zhì)及生物活性的影響尚未見報道。因此，選擇以蘋果為原料，以品質(zhì)、功效酶和抗氧化能力等相關(guān)指標(biāo)為衡量標(biāo)準(zhǔn)，研究初始pH、糖添加量、料液比等發(fā)酵條件對自然發(fā)酵蘋果酵素品質(zhì)及生物活性的影響，以期為蘋果酵素產(chǎn)品質(zhì)量控制和指導(dǎo)生產(chǎn)實踐提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富士蘋果采自甘肅省慶陽市有機蘋果基地；果糖、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、DPPH、乙醇、ABTS、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、淀粉酶試劑盒、鹽酸、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯醇、橄欖油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、無水硫酸鈉、酒石酸鈉、苯酚、3, 5-二硝基水楊酸等試劑由中瑞化學(xué)試劑公司提供，所用試劑均為分析純。

UV-1100型紫外可見分光光度計，上海凌析達儀器有限公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MIRCOCL 17R離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超低溫冰箱，青島海爾集團；DL-CJ-1N超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PB-10型精密pH計，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果酵素制備

操作要點：新鮮蘋果清洗、瀝干水分后去皮、去核并切分成3～5 mm的片，將蘋果片與純凈水按質(zhì)量比加入無菌酵素發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)糖度及pH，在常溫（20～26 ℃）下自然發(fā)酵3個月，發(fā)酵結(jié)束過濾分離得到蘋果酵素產(chǎn)品，取樣進行指標(biāo)測定，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 品質(zhì)指標(biāo)的測定

pH采用pH計法測定；可溶性固形物含量采用糖度計法測定；總酸的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》方法。

感官指標(biāo)的測定依據(jù)GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評價員一般導(dǎo)則第1部分：優(yōu)選評價員》要求，篩選出6名評價員組成感官評價小組，對其進行蘋果酵素的感官評價培訓(xùn)，并根據(jù)QB/T 5323—2018《植物酵素》中食用植物酵素的規(guī)定對蘋果酵素的色澤、組織形態(tài)、滋味、氣味、雜質(zhì)等應(yīng)用9點標(biāo)度法[21]進行感官評價，見表1。評價時采用3位數(shù)字隨機編碼保證樣品提供的一致性，以隨機的順序提供，評價小組3次重復(fù)后的平均分為指標(biāo)定量結(jié)果。

表1 蘋果酵素感官評價描述詞標(biāo)度

1.2.4 抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、還原力的測定參考樊秋元[22]的方法。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每組試驗重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進行分析處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對蘋果酵素品質(zhì)的影響

2.1.1 初始pH對蘋果酵素品質(zhì)的影響

pH、可溶性固形物、總酸等是衡量酵素發(fā)酵成熟的主要指標(biāo)，感官評價也是反應(yīng)酵素品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖1可以看出，隨著初始pH的升高，蘋果酵素產(chǎn)品的pH和可溶性固形物含量均呈先降低后升高趨勢，其中pH 4.5時最低，分別為3.06和3.4 °Brix；總酸含量和感官評價則呈反向趨勢，先升高后降低，pH 4.5時達到峰值，分別為2.91 g/L和7.41。說明pH 4.5的發(fā)酵環(huán)境適合蘋果酵素自然發(fā)酵微生物快速繁殖和生長代謝，有利于提高產(chǎn)品的品質(zhì)。

圖1 初始pH對蘋果酵素品質(zhì)的影響

2.1.2 糖添加量對蘋果酵素品質(zhì)的影響

如圖2所示，發(fā)酵液中不添加糖時，蘋果酵素產(chǎn)品的pH較高，為3.55，可溶性固形物和總酸含量均較低，分別為3.4 °Brix和0.82 g/L，隨著糖添加量的增加，pH呈先降低后升高的趨勢，糖添加量15%時最低，為3.03；可溶性固形物則隨著糖添加量的增加而逐漸升高；總酸和感官評價的變化趨勢為先升高后降低，糖添加量15%時達到最大值3.24 g/L和7.29。說明發(fā)酵液中糖添加量過高或過低，都可能嚴(yán)重影響微生物的生長和產(chǎn)物的合成，發(fā)酵進程不能順利進行，產(chǎn)品品質(zhì)受到影響。

圖2 糖添加量對蘋果酵素品質(zhì)的影響

2.1.3 料液比值對蘋果酵素品質(zhì)的影響

由圖3可知，不同料液比值對蘋果酵素的pH、可溶性固形物、總酸、感官評價、還原力和SOD活性均有不同程度的影響。如圖3所示，料液比值在100～200 g/L時，pH、可溶性固形物呈下降趨勢，料液比值在200 g/L時最低，分別為3.06和4.2 °Brix，之后隨著料液比的增加逐漸上升；而總酸和感官評價的變化趨勢正好相反，在料液比值為200 g/L時達到最大值3.99 g/L和7.6。說明只有在適宜的料液比下蘋果酵素才能發(fā)酵完全，保證產(chǎn)品品質(zhì)。

圖3 料液比值對蘋果酵素品質(zhì)的影響

2.2 發(fā)酵條件對蘋果酵素生物活性的影響

2.2.1 初始pH對蘋果酵素生物活性的影響

如圖4所示，蘋果酵素中存在SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶，且5種酶的活性均隨著初始pH的升高呈先升高后降低趨勢，其中SOD和纖維素酶的含量較高，pH 4.5時分別達到最大值41.54和27.34 U/mL，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的含量較低，pH 4.5時達到最大值，分別為8.09，5.08和2.15 U/mL，均高于pH 4.0和pH 5.0條件下發(fā)酵的；初始pH對各自由基清除率和還原力的影響趨勢與功效酶的變化趨勢一致，pH 4.5時，DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除率、ABTS自由基清除率和還原力達到最大值，分別為78.29%，65.06%，71.01%，68.28%和1.84（OD700nm值），說明適宜的pH有利于蘋果酵素發(fā)酵過程生物活性物質(zhì)的合成，表現(xiàn)出較強的酶活性和自由基清除能力。

圖4 初始pH對蘋果酵素生物活性的影響

2.2.2 糖添加量對蘋果酵素生物活性的影響

圖5中，SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等功效酶的活性以及DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS自由基等清除能力的變化在0～15%之間呈上升趨勢，當(dāng)糖添加量為15%時達到最大值，5種酶分別為33.12，22.75，9.22，5.15和0.14 U/mL，4種自由基清除率分別為83.17%，65.08%，79.03%和52.01%，之后隨著糖添加量增加逐漸下降；而還原力則隨著糖添加量的增加而一直增大，這可能與發(fā)酵液中還原糖的增加有關(guān)，與肖夢月等[23]的研究結(jié)果一致。說明發(fā)酵液中糖添加量過高或過低，都可能嚴(yán)重影響微生物的生長和產(chǎn)物的合成，進而影響蘋果酵素中各種酶的活性和自由基清除能力。

圖5 糖添加量對蘋果酵素生物活性的影響

2.2.3 料液比值對蘋果酵素生物活性的影響

由圖6可知，不同料液比值對蘋果酵素的SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等功效酶的活性、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS自由基等清除能力以及還原力均有不同程度的影響，隨著料液比的增加呈先升高后降低趨勢，當(dāng)料液比值為200 g/L時達到最大值，5種酶分別為32.28，25.15，10.18，6.10和1.19 U/mL，4種自由基清除率分別為82.51%，68.45%，77.26%和62.69%，還原力為2.18（OD700nm值）。說明只有在適宜的料液比值下蘋果酵素的酶活性和自由基清除能力才會更強。

圖6 料液比值對蘋果酵素生物活性的影響

3 結(jié)論與討論

食用植物酵素作為一種功能性微生物發(fā)酵制品因其豐富的營養(yǎng)和顯著的功效多年來盛行于歐美、東南亞、日本以及中國臺灣地區(qū)，受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[24]。酵素發(fā)酵技術(shù)通過復(fù)雜的物質(zhì)代謝，不僅可以改善果蔬原料原有的一些不良風(fēng)味，還可以產(chǎn)生一些新的生物活性成分，增加酵素食品的風(fēng)味、口感及功效，提高產(chǎn)品品質(zhì)[25]。目前有關(guān)酵素的抗氧化性能的研究較多，陳爽等[26]和張夢梅等[27]研究發(fā)現(xiàn)，酵素產(chǎn)品通過有益微生物的發(fā)酵，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等功效酶均有一定活力和較好的抗氧化能力，且酵素富含的多酚、黃酮以及功效酶等物質(zhì)能夠有效清除機體內(nèi)自由基[28]。研究中，蘋果酵素中存在SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等有活力的功效酶，且產(chǎn)品具有一定的清除DPPH、超氧陰離子、羥基、ABTS等自由基的能力。

適宜的發(fā)酵條件是保證酵素產(chǎn)品品質(zhì)和功效的關(guān)鍵[29]。pH是微生物代謝的綜合反映，影響發(fā)酵產(chǎn)品微生物的生長和產(chǎn)物的合成，pH過高或過低均會抑制微生物的生長以及酶的活性，適宜的初始pH有利于提高碳水化合物的利用率，使得發(fā)酵液中可溶性固形物降低，同時可能由于發(fā)酵過程中乳酸、乙酸、蘋果酸等有機酸含量增加，引起總酸含量增加，產(chǎn)品的pH隨之降低[30]，因此，蘋果酵素發(fā)酵液的初始pH是十分重要的參數(shù)。研究表明，初始pH 4.5時，產(chǎn)品發(fā)酵完全，pH和可溶性固形物最低，分別為3.06和3.4 °Brix；總酸含量和感官評價最高，分別為2.91 g/L和7.41；SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶的活力最好，分別為41.54，27.34，8.09，5.08和2.15 U/mL，清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS自由基的能力以及還原力最高，分別為78.29%，65.06%，71.01%，68.28%和1.84（OD700nm值），說明pH 4.5的發(fā)酵環(huán)境適合蘋果酵素自然發(fā)酵微生物快速繁殖和生長代謝，保證了產(chǎn)品的品質(zhì)和酶活性，進而影響自由基的清除能力，這與朱德艷[31]的研究結(jié)果一致。碳水化合物是微生物生長的重要影響因子，微生物通過消耗碳水化合物完成生長代謝的過程[32]。研究中，當(dāng)糖添加量15%時，pH下降最快，為3.03，總酸和感官評價最高，分別為3.24 g/L和7.29；SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等5種功效酶的活力分別為33.12，22.75，9.22，5.15和0.14 U/mL，DPPH、超氧陰離子、羥基、ABTS等4種自由基清除率分別為83.17%，65.08%，79.03%和52.01%，這是因為糖添加量過低，發(fā)酵不完全，產(chǎn)物少，產(chǎn)品品質(zhì)及生物活性較低；糖添加量過高，發(fā)酵液的滲透壓增加，微生物正常生長代謝受到抑制，發(fā)酵進程不能順利進行，pH下降受阻，總酸、感官評價等品質(zhì)指標(biāo)及生物活性均受到影響。加水會降低發(fā)酵體系中的糖濃度而降低高滲透壓，并升高發(fā)酵液pH，降低二者對微生物生長和發(fā)酵的影響，但只有在適宜的料液比下食用酵素才能發(fā)酵完全，保證產(chǎn)品品質(zhì)，繼續(xù)增加加水量，會使發(fā)酵體系中糖濃度過低，pH過高，不利于發(fā)酵，因此，適宜的料液比值也是微生物酵素發(fā)酵成功的重要因素[33]。研究采用的料液比中，當(dāng)料液比值在200 g/L時，產(chǎn)品的pH和可溶性固形物最低，分別為3.06和4.2 °Brix，總酸和感官評價達到最大值3.99 g/L和7.6；5種酶活力最好，分別為32.28，25.15，10.18，6.10和1.19 U/mL，4種自由基清除率最高，分別為82.51%，68.45%，77.26%和62.69%，還原力為2.18（OD700nm值）。

綜上所述，蘋果酵素自然發(fā)酵中，當(dāng)發(fā)酵條件為初始pH 4.5，糖添加量15.00%，料液比值200 g/L時，產(chǎn)品的品質(zhì)及生物活性最高。有研究表明，食用植物酵素的品質(zhì)及生物活性與植物本身有較大的關(guān)系[34]，因此，有關(guān)蘋果酵素品質(zhì)與生物活性變化與原料的關(guān)系，以及自然發(fā)酵過程中的變化規(guī)律有待于進一步研究。