朱月霞，戚嘉怡，喻樊 ，繆怡燁

1.鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院（鹽城 224051）；2.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設(shè)實驗室（鹽城 224002）；3.南京工業(yè)大學(xué)（南京 210000）

亞麻酸（linoleic acid，LA）是一種天然的疏水不飽和脂肪酸，有助于食品的風(fēng)味和稠度，并使人在進食時感到飽足，對動物和人體無毒[1]。亞麻酸外觀呈淡黃色液體，容易氧化[2]。另外，亞麻酸能降血脂、治療肥胖癥、預(yù)防非酒精性肝炎，還能對癌癥有一定的治療作用，包括減少癌細胞的生成、轉(zhuǎn)移和減少腫瘤面積[3-6]。但動物體內(nèi)不能合成亞麻酸，只能從外界獲取。

近年來對亞麻酸的劑型的研究中，制備成膠囊[7-8]較多，也有制備成脂質(zhì)體[9]。但將亞麻酸制備成納米乳的報道很少。納米乳是由水、油、乳化劑和助乳化劑組成的膠體分散體系，具有熱力學(xué)穩(wěn)定性好、液滴小等特點，粒徑在10～200 nm之間，作為載體可以提高藥物的生物利用度[10-11]。此次試驗將亞麻酸制成納米乳，對亞麻酸的應(yīng)用具有重要的意義，為亞麻酸的劑型研究提供了參考。

1 材料

1.1 主要儀器與設(shè)備

臺式電動離心機（常州國華電器有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；B11-3型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；JEM-1400 plus透射電子顯微鏡（日本）。

1.2 主要材料與試劑

亞麻酸（許昌元化生物科技有限公司）；油酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大豆油（上海泰坦科技股份有限公司）；棕櫚酸異丙酯（山東優(yōu)索化工科技有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯（山東優(yōu)索化工科技有限公司）；聚山梨酯80（Tween-80，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；Span-80（上海展云化工有限公司）；OP-10（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1, 2-丙二醇（上海展云化工有限公司）；聚乙二醇-400（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；焦性沒食子酸（鄰苯三酚，上海展云化工有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，上海藍季生物有限公司）；DPPH（上海藍季生物有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）；大腸桿菌（CMCC（B）44102）；金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）；等。

2 試驗方法

2.1 標準曲線的繪制

以無水乙醇為溶劑制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL的亞麻酸母液，在190～1 100 nm范圍內(nèi)用紫外分光光度計進行掃描。結(jié)果顯示，亞麻酸的乙醇溶液在234 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故最大吸收波長選擇234 nm。稀釋亞麻酸母液制備梯度濃度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mg/mL，橫坐標為亞麻酸溶液的質(zhì)量濃度，縱坐標為吸光度，對其進行線性回歸，得亞麻酸標準曲線方程。

2.2 亞麻酸納米乳的制備

2.2.1 亞麻酸納米乳輔料的篩選[12]

選擇大豆油、棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸為備選油相，Tween-80、Span-80、OP-10為備選乳化劑，1, 2-丙二醇、聚乙二醇-400為備選助乳化劑。取適量的亞麻酸置離心管，加適量油相、乳化劑和助乳化劑，觀察二者是否相融以及融合后的現(xiàn)象，并且測定各混合組分的吸光度，通過計算亞麻酸在各種溶劑中的溶解度來篩選最適的輔料。

2.2.2 偽三元相圖篩選亞麻酸納米乳處方[13]

將油相與乳化劑和助乳化劑組成的混合乳化劑（Km=1∶1，2∶1和3∶1）按照質(zhì)量比1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1的比例混合，在磁力攪拌器上恒溫恒速攪拌，緩緩滴加純化水，觀察體系溶液由渾濁變澄清或由澄清變渾濁的現(xiàn)象，記錄臨界點，計算各組分百分比。用Origin Pro 8.0軟件繪制偽三元相圖。

2.2.3 亞麻酸納米乳的制備

稱取處方量的亞麻酸、油相、乳化劑、助乳化劑，緩緩滴加純化水，在磁力攪拌器上充分攪拌混勻，可制得略帶淡藍色乳光且外觀澄清的亞麻酸納米乳。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 羥自由基清除率

采用水楊酸法[14]測定亞麻酸的羥基自由基清除活性。在還原性過渡金屬Fe2+和H2O2存在的情況下，F(xiàn)enton反應(yīng)可以形成羥基自由基，H2O2是所有還原性二氧化合物中反應(yīng)最活躍的，被認為會引發(fā)細胞損傷[15]。Fenton反應(yīng)為H2O2+Fe2+＝OH-+H2O+Fe3+，且生成物在510 nm處有特征吸收。

制備質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣品溶液。各溶液的加入量如表1所示，依次加入9 mmol/L的FeSO4、9 mmol/L的乙醇-水楊酸、8.8 mmol/L的H2O2后搖勻，于37 ℃水浴加熱15 min后取出，以不加雙氧水的體系為參比溶液，搖勻測定吸光度。

表1 羥自由基清除試驗 單位：mL

式中：A0為空白對照的吸光度；Ax為加樣品的吸光度；Ax0為不加顯色劑H2O2的吸光度。

2.3.2 超氧自由基清除率

采取鄰苯三酚自氧化法[16]測定亞麻酸的超氧自由基的活性。

在比色皿中依次加入0.1 mol/L Tris-HCl，3 mmol/L的鄰苯三酚和樣品溶液后搖勻測定樣品，即Ai，設(shè)置測定波長325 nm，并每隔30 s讀數(shù)1次，至300 s為止，參比溶液為0.1 mol/L Tris-HCl溶液。同時空白以10 mmol/L的HCl溶液代替鄰苯三酚同上進行測定，即A0。清除率按式（2）計算。

2.3.3 DPPH自由基清除率

DPPH法是一種準確、簡便的試驗，用于測定樣品的抗氧化能力。深紫色的穩(wěn)定DPPH自由基溶液在517 nm處顯示出強吸收帶。在抗氧化劑存在下，由于抗氧化分子1, 1-二苯基-2-苦基肼（黃色）的DPPH自由基（紫色）減少，吸光度降低[17]。

各溶液的加入量如表2所示。分別移取不同體積的樣品溶液，超純水補足至1 mL，再加1 mL的DPPH溶液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，參比溶液為超純水，在517 nm波長下測定吸光度，即Aj。另外1 mL樣品溶液加1 mL的無水乙醇作為空白對照測定吸光度，即Ai。同時1 mL的超純水加1 mL的DPPH溶液測定吸光度，即A0。清除率按式（3）計算。

表2 DPPH自由基清除試驗 單位：μL

2.4 納米乳的表征

2.4.1 包封率

包封率是衡量納米乳液質(zhì)量的一個重要指標，采用微柱離心法[18]對亞麻酸納米乳的包封率進行檢測。SephadexG-75葡聚糖凝膠在去離子水中浸泡過夜，充分溶脹。取2.5 mL注射器去掉內(nèi)芯，取一點棉花墊入注射器內(nèi)，然后剪下合適大小的濾紙墊入其中，將浸泡好的SephadexG-75少量多次加入，靜置一段時間后放入離心機中，以100 r/min離心1 min，得到高度約1 cm的獨立凝膠柱。取100 μL空白納米乳，加入微型凝膠柱的頂端，靜置預(yù)飽和20～30 min。取30 μL制備好的亞麻酸納米乳，加于微型凝膠柱的頂端，加2 mL純化水，并用100 r/min離心1 min，收集洗脫液，連續(xù)操作，每次收集的洗脫液加入容量瓶中，用無水乙醇定容。測定吸光度，直至吸光度接近0說明洗脫完成，并以管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線選擇需要洗脫的管數(shù)，并將這幾管的洗脫液合并，用無水乙醇定容至10 mL。同時，取30 μL亞麻酸納米乳，用無水乙醇定容至10 mL。用紫外分光光度計在234 nm處分別測定亞麻酸洗脫前和洗脫后的吸光度，根據(jù)式（4）計算包封率。

式中：C柱后為微柱離心后納米乳中的藥物的質(zhì)量濃度；C柱前為微柱離心前納米乳中的藥物的總質(zhì)量濃度。

2.4.2 形態(tài)觀察[19]

取適量制得的亞麻酸納米乳，蒸餾水稀釋100倍，滴在銅網(wǎng)上，靜置一段時間，用濾紙吸干，滴加2%磷鎢酸溶液負染5～10 min，自然揮發(fā)干，通過透射電子顯微鏡觀察納米乳形態(tài)。

2.5 抑菌活性[20]

取培養(yǎng)好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液，至超凈臺操作。每支試管中加900 μL的生理鹽水，再用移液槍取100 μL培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液加至第一支試管混勻，記為10-1CFU/mL。再取100 μL第一支試管中菌液至第二支試管，以此類推，將菌液稀釋至10-7CFU/mL。金黃色葡萄球菌的稀釋操作同上。

制備質(zhì)量濃度為0.50，0.25和0.125 mg/mL的亞麻酸納米乳溶液，同時陰性對照空白納米乳也稀釋相應(yīng)的質(zhì)量濃度，配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的陽性對照青霉素標準液。滅菌后營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后倒平板，加5 μL上述稀釋好的菌液涂布后放至水平位置待用，在培養(yǎng)皿中等間距放3～4個牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑7.8 mm，高10 mm），并加入200 μL上述不同質(zhì)量濃度的溶液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，然后測量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線

亞麻酸的乙醇溶液在234 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故最大吸收波長選擇234 nm。以亞麻酸溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸，亞麻酸標準曲線方程為y=1.006 1x+0.109 7（r2=0.994 1），表明亞麻酸在質(zhì)量濃度為0.1～0.8 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 亞麻酸納米乳的制備

3.2.1 亞麻酸在各輔料中的溶解度

從表3可以看出，在4種油相中，亞麻酸在油酸中的溶解度最大；在3種乳化劑中，亞麻酸在Tween-80中的溶解度較好；在2種助乳化劑中，亞麻酸在1, 2-丙二醇中的溶解度較高。因此，以油酸為油相，Tween-80為助乳化劑，1, 2-丙二醇為助乳化劑做進一步研究。

表3 各種不同溶劑中亞麻酸的溶解度

3.2.2 偽三元相圖

繪出偽三元相圖后，用image J軟件比較不同Km值的相圖面積。由圖1和表4可知，當油酸-Tween-80-1, 2-丙二醇-水的處方在Km=2∶1時面積最大，根據(jù)納米乳外觀，選擇1∶9比例的油相與混合乳化劑。

表4 不同Km值的偽三元相圖面積

圖1 不同Km值下空白納米乳的偽三元相圖

3.2.3 制備亞麻酸納米乳

確定亞麻酸納米乳的最佳配方：亞麻酸2.26%、油酸2.26%、Tween-80 13.53%、1, 2-丙二醇6.76%、純化水75.19%。稱取亞麻酸、油相、乳化劑、助乳化劑，緩慢純化水，在磁力攪拌器充分攪拌混勻不斷攪拌，制備的亞麻酸納米乳略帶淡藍色乳光且外觀澄清。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 羥自由基清除率

載藥納米乳的組成為亞麻酸、油酸、Tween-80、1, 2-丙二醇，測得A0為0.863（見表5）。

表5 載藥納米乳的羥自由基清除率

結(jié)果表明含亞麻酸的載藥納米乳的羥自由基清除率大，同時含油酸的空白納米乳也有一定的羥自由基清除作用（見表6）。

表6 空白納米乳的羥自由基清除率

3.3.2 超氧自由基清除率

采用的樣品質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，計算得載藥納米乳的超氧自由基清除率為23.08%，空白納米乳的超氧自由基清除率為17.58%。考慮到油酸的影響，所以對同時不含油酸和亞麻酸的組分也進行了測定，不含油相組分的超氧自由基清除率為12.09%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比較空白納米乳，含亞麻酸的載藥納米乳的超氧自由基清除率較大，有一定的超氧自由基清除作用。相比較不含油相的納米乳，空白納米乳的清除率較高，則表明油酸也有一定的超氧自由基清除率。

3.3.3 DPPH自由基清除率

樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL的載藥納米乳和空白納米乳，由表7可以發(fā)現(xiàn)，空白納米乳的DPPH自由基清除率很小，是由于樣品質(zhì)量濃度的影響。但是從數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)載藥納米乳的DPPH自由基清除率比空白納米乳的大，說明亞麻酸有一定的DPPH自由基清除能力。

表7 DPPH自由基清除率測定結(jié)果

3.4 納米乳的表征

3.4.1 包封率

根據(jù)圖2的洗脫曲線，選擇前4管的洗脫液合并測定吸光度。經(jīng)紫外分光光度計測定，微柱離心后的吸光度為0.297，微柱離心前的吸光度為0.390。根據(jù)標準曲線計算得C柱后為0.186 mg/mL，C柱前為0.279 mg/mL，包封率為66.7%。

圖2 亞麻酸的洗脫曲線

3.4.2 形態(tài)觀察

由圖3可以看出，納米乳微觀形態(tài)呈球形，乳滴分布均勻無粘連，粒徑約176 nm。

圖3 亞麻酸納米乳透射電鏡微觀形態(tài)

3.5 抑菌活性

由表8可知，空白納米乳無抑菌性，亞麻酸納米乳的抑菌效果低于青霉素標準液，3個濃度的亞麻酸納米乳對兩種菌均有較好的抑菌效果，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的抑菌效果最好。

表8 抑菌試驗結(jié)果

4 討論與結(jié)論

采用偽三元相圖篩選亞麻酸納米乳的最適處方，目測觀察渾濁到澄清現(xiàn)象來判斷相轉(zhuǎn)變的臨界點。試驗發(fā)現(xiàn)，并不是所有的比例均能形成納米乳，納米乳是透明或透明略帶乳光的液體狀，而有些是形成乳白色不透明的液體狀，后需加很大比例的水才會逐漸變成透明樣，一些不易形成的點繪制偽三元相圖時，選擇由黏狀的液晶態(tài)到液體狀的臨界點來繪圖。

考察了亞麻酸的抗氧化活性，包括羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基三個方面。清除羥自由基是一種重要的抗氧化活性，羥自由基具有很高的反應(yīng)活性，使其能夠與活細胞中廣泛存在的分子（如糖、氨基酸、脂類和核苷酸）發(fā)生反應(yīng)。超氧自由基對細胞成分非常有害，它容易與DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，需要在生物系統(tǒng)中立即清除。DPPH存在一個穩(wěn)定的自由基，常被用于測定天然化合物的自由基清除活性，在DPPH試驗中研究了亞麻酸作為氫原子或電子供體將DPPH轉(zhuǎn)化為縮合型DPPH-H的能力。試驗發(fā)現(xiàn)，含油酸的組分與不含油相的組分相比較高，說明油酸有一定的自由基清除能力，而當組分中加入亞麻酸后清除率有很大的提高，說明亞麻酸自由基清除能力強。采用牛津杯法測定亞麻酸的抑菌活性，試驗發(fā)現(xiàn)亞麻酸納米乳有較好的抑菌效果。