張燕麗，尹佳樂，陳越，宋振康，閆小娟，張海悅,

1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（長春 130012）；2.吉林省富生特醫(yī)食品有限公司（長春 130012）

向日葵（Helianthus annuusL.）又稱太陽花，隸屬于菊科向日葵屬（Helianthus）[1]。向日葵的原產(chǎn)地為北美洲，約在明朝時(shí)引入中國，如今可知最早記載向日葵的中國文獻(xiàn)為明朝人王象[2]。向日葵一身是藥，其種子、花盤、莖葉、莖髓、根、花等均可入藥。其中花盤主要營養(yǎng)成分是7%～9%粗蛋白、6.5%～10.5%粗脂肪、17.1%粗纖維、10%灰粉、43.9%無氮浸出物、40.0%～48.9%粗淀粉、2.4%～3.0%果膠。

綠原酸具有抗菌[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、保肝[6]、降血脂[7]、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)[8]、降壓、抗氧化[9]、抗衰老、抗肌肉骨骼老化[10]、抗腫瘤[11-12]、抗白血病[13]和降血糖[14]等生物活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、化工、食品[15]及化妝品等領(lǐng)域。但由于技術(shù)條件的限制，我國綠原酸的純品依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴。中國向日葵生產(chǎn)種植發(fā)展成為僅次于油菜籽、大豆、棉籽和花生的第五大油料作物，年總產(chǎn)量位居世界第6位，但對(duì)向日葵副產(chǎn)品的利用仍不十分合理，尤其是向日葵花盤，中國的大部分地區(qū)都用于飼養(yǎng)牲畜[16]。因此，合理利用已有的豐富資源，大力開展綠原酸提取純化與綠原酸產(chǎn)品的研究開發(fā)，對(duì)中國植物資源開發(fā)利用具有現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

提取綠原酸的方法有水提法[17-18]、醇提法[19-20]、微波輔助提取法[21-23]、超聲波法[24]等。研究主要針對(duì)超聲波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于蒲公英[25]、山銀花[26]等，但響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取葵花盤中的綠原酸尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。試驗(yàn)通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取葵花盤中綠原酸的工藝條件，為向日葵花盤的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

葵花盤（河北源創(chuàng)生物科技有限公司）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品檢驗(yàn)研究所）；無水乙醇（陜西森弗天然制品有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子分析天平（JA2003N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；紫外風(fēng)光光度計(jì)（SKD-08S，上海沛歐分析儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電冰箱（NR-B25WS1，無錫松下冷機(jī)有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（SKD-200，上海沛歐分析儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將葵花盤除雜，經(jīng)純水清洗，將其放入70 ℃烘干箱中烘干，烘干至恒重粉碎，過0.150 nm篩后裝在密封袋中，備用。

1.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.001 g綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容。搖勻即可得質(zhì)量濃度20 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品分別置于6個(gè)10 mL容量瓶里，用無水乙醇定容，搖勻，以無水乙醇作參比，在最大吸收波長330 nm處測定其吸光度，以綠原酸的質(zhì)量濃度為x軸，吸光度為y軸，繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=0.051 2X-0.087 6，R2=0.999 1，線性關(guān)系良好。

1.3.3 葵花盤中綠原酸的檢測

準(zhǔn)確吸取1 mL綠原酸提取液，用無水乙醇定容至50 mL容量瓶中。以無水乙醇作為參比液，用紫外可見分光光度計(jì)在200～700 nm范圍內(nèi)掃描。

1.3.4 綠原酸得率計(jì)算

式中：R1為綠原酸得率，mg/g；Y為根據(jù)回歸方程計(jì)算所得的綠原酸質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；B為葵花盤質(zhì)量，g；103為質(zhì)量換算系數(shù)。

1.3.5 葵花盤綠原酸的提取方法篩選

1.3.5.1 水提取法

準(zhǔn)確稱取30 g樣品于250 mL錐形瓶中，設(shè)計(jì)：溫度分別為40，50，60，70和80 ℃；料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL）；時(shí)間分別為10，20，30，40和50 min。在此條件下提取3次，過濾合并濾液，得到最優(yōu)提取條件：溫度70 ℃，料液比1∶40（g/mL），時(shí)間50 min。

1.3.5.2 乙醇提取法

準(zhǔn)確稱取30 g樣品于250 mL錐形瓶中，設(shè)計(jì)：溫度分別為40，50，60，70和80 ℃；料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL）；時(shí)間分別為10，20，30，40和50 min；乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%，30%，40%，50%和60%。在此條件下提取3次，過濾合并濾液，得到最優(yōu)提取條件：溫度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）、時(shí)間40 min。

1.3.5.3 超聲提取法

準(zhǔn)確稱取30 g樣品于250 mL錐形瓶中，設(shè)計(jì)：溫度分別為40，50，60，70和80 ℃；料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL）；超聲時(shí)間分別為10，20，30，40和50 min；乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%，30%，40%，50%和60%。在此條件下提取3次，過濾合并濾液，得到最優(yōu)提取條件：溫度60℃，料液比1∶40（g/mL），時(shí)間40 min。在上述最優(yōu)條件下各做3組平行試驗(yàn)做對(duì)比。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取30 g葵花盤粉，置于250 mL錐形瓶中。在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶40（g/mL）、超聲時(shí)間30 min、超聲功率80 W的條件下，分別考察超聲溫度40，50，60，70和80 ℃對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響；在超聲溫度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）、超聲時(shí)間30 min、超聲功率80 W的條件下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，30%，40%，50%和60%對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響；在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲溫度60℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率80 W的條件下，分別考察料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL）對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響；在料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲溫度60 ℃，超聲功率80 W的條件下，分別考察超聲時(shí)間10，20，30，40和50 min對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響；在料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間30 min的條件下，分別考察超聲功率60，70，80，90和100 W對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化葵花盤中綠原酸提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用中心組合Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比3個(gè)因素為自變量進(jìn)行組合優(yōu)化，進(jìn)行響應(yīng)面分析，設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 葵花盤綠原酸檢測結(jié)果

通過全波長掃描圖得到葵花盤綠原酸的最大吸收波長330 nm，根據(jù)文獻(xiàn)[27]報(bào)道，此處屬于綠原酸的特征吸收峰，因此確定葵花盤中含有綠原酸。

2.2 葵花盤中綠原酸提取方法選擇結(jié)果

從表2可以看出，超聲輔助醇提法的得率最高，因此選擇響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助醇提法提取葵花盤中的綠原酸。

表2 3種提取方法的綠原酸得率比較 單位：mg/g

圖1 葵花盤綠原酸紫外吸收光譜圖

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲溫度對(duì)葵花盤中綠原酸得率的影響

由圖2可知，在40～60 ℃之間葵花盤中綠原酸得率隨著超聲溫度升高而增大，因?yàn)闇囟壬撸肿舆\(yùn)動(dòng)加快，使得細(xì)胞破裂進(jìn)一步導(dǎo)致葵花盤中綠原酸的溶解及擴(kuò)散速度加快。故在超聲溫度60 ℃時(shí)，葵花盤中綠原酸得率達(dá)到最大值5.14（mg/g）。在60～80 ℃之間，隨著溫度升高，綠原酸得率反而下降，可能是因?yàn)殡S著溫度升高，葵花盤中綠原酸一部分有效成分被分解。故超聲溫度范圍優(yōu)選50～70 ℃。

圖2 超聲溫度對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸得率的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，葵花盤綠原酸得率逐漸增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%時(shí)葵花盤綠原酸得率達(dá)到最大值5.38（mg/g）。繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，導(dǎo)致綠原酸得率出現(xiàn)下降現(xiàn)象，故乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍宜選30%～50%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響

2.3.3 料液比對(duì)綠原酸得率的影響

由圖4可知，隨著料液比增大，葵花盤綠原酸得率先增大后減小，在上升階段，固體與液體比例增加，前后得率之間差異增加。料液比1∶40（g/mL）時(shí)，得率達(dá)到最大值5.15（mg/g）。因此，料液比范圍優(yōu)選1∶30～1∶50（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)葵花盤綠原酸得率的影響

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響

由圖5可知，在超聲時(shí)間0～40 min內(nèi)，隨著超聲時(shí)間延長，綠原酸得率逐漸增加，并在超聲時(shí)間40 min時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大值5.49（mg/g），可能是由于超聲波的空穴效應(yīng)促進(jìn)溶質(zhì)的傳遞，加速綠原酸的溶出；超聲時(shí)間大于40 min時(shí)，得率有所減少，這是因?yàn)榫G原酸溶出率減小，同時(shí)超聲波會(huì)導(dǎo)致部分綠原酸降解。綜上，超聲時(shí)間選取40 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響

2.3.5 超聲功率對(duì)綠原酸得率的影響

由圖6可以看出，隨著超聲功率增大，綠原酸得率先增大后減小。超聲能夠產(chǎn)生空化作用，這種空化效應(yīng)對(duì)物料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，使得有效成分很容易滲出，從而得率提高；同時(shí)，超聲對(duì)萃取溶劑起到攪拌作用，減小界面阻力從而促進(jìn)物料與溶劑邊界層的物質(zhì)交換。綜上，超聲功率選擇90 W。

圖6 超聲功率對(duì)綠原酸得率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用中心組合Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 回歸模型的建立以及方差分析

由表4可知，A和A2對(duì)綠原酸提取的影響極其顯著，B、C 對(duì)提取的影響非常顯著。由F值得大小可以推斷出，這3個(gè)因素在所規(guī)定的范圍內(nèi)對(duì)葵花盤綠原酸提取的影響程度依次為A（溫度）＞C（料液比）＞B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。應(yīng)用Box-Behnken軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，對(duì)超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比3個(gè)因素進(jìn)行擬合，得到多元響應(yīng)面回歸模型：R1=5.76+0.81A-0.26B+0.46C-0.45AB+0.25AC+0.26BC-1.79A2-0.48B2-0.44C2。回歸模型p＜0.000 1，失擬項(xiàng)p=0.255 2＞0.05，R2=0.989 3，說明回歸方程顯著、失擬項(xiàng)不顯著，響應(yīng)面回歸方程擬合程度良好。

表4 葵花盤中綠原酸得率回歸模型方差分析表

2.4.3 響應(yīng)面和等高線圖結(jié)果

由圖7可以直觀地看出超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)葵花盤綠原酸的提取均有顯著影響及各因素之間交互作用的顯著程度。通過響應(yīng)面曲面的坡度可以直接反映因素發(fā)生變化時(shí)葵花盤綠原酸得率的響應(yīng)靈敏度，等高線圖呈橢圓形時(shí)說明兩因素交互作用顯著[28]。從圖7中可以看出超聲溫度和料液比的交互作用明顯。

圖7 各因素交互作用對(duì)綠原酸得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.4.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件：超聲溫度62.94 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)37.32%、料液比1∶45.29（g/mL）。在此條件下，模型預(yù)測葵花盤綠原酸得率為6.03 mg/g。為便于控制葵花盤綠原酸提取條件，提取參數(shù)設(shè)置為超聲溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶50（g/mL）。在此條件下開展綠原酸提取的3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示葵花盤綠原酸得率平均值為6.01（mg/g），實(shí)際值與理論值基本相符，說明模型對(duì)葵花盤綠原酸提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行，具有一定實(shí)用價(jià)值。

表5 最佳工藝的驗(yàn)證 單位：mg/g

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)利用超聲波輔助醇提法對(duì)葵花盤綠原酸進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)，提取葵花盤綠原酸最優(yōu)條件為超聲溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶50（g/mL）、超聲時(shí)間40 min、超聲功率90 W。在此條件下，葵花盤綠原酸得率為6.01 mg/g，與回歸方程的預(yù)測值接近，具有一定的實(shí)用價(jià)值。后續(xù)將對(duì)葵花盤中的綠原酸進(jìn)行分離純化和活性功能的研究，為葵花盤綠原酸的深入研究提供理論依據(jù)。