劉艷 李學(xué)云 郝萬(wàn)鵬

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性法身變化（減弱或消失），就可導(dǎo)致血清Hcy代謝異常，從而引起高同型半胱氨酸血癥（hypehomooysteinaemia，HHcy）。H型高血壓就是高血壓患者中伴有Hcy濃度的升高。研究結(jié)果顯示，亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR基因）C677T基因多態(tài)性的分布頻率與Hcy及葉酸水平有著密切的聯(lián)系，因而H型高血壓的發(fā)生、發(fā)展和MTHFR基因的分布頻率有很大的關(guān)系。根據(jù)我國(guó)H型高血壓患者的MTHFR基因型及Hcy與葉酸水平進(jìn)行流行病傳染病學(xué)基因調(diào)查，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的TT基因型頻率相對(duì)較高[1]。研究表明，引起高Hcy血癥及H型高血壓的根本原因是我國(guó)人群中TT型基因的出現(xiàn)頻率高。Hcy水平與葉酸呈負(fù)相關(guān)[2-3]。基于此，本研究小組選擇烏魯木齊地區(qū)漢族H型高血壓患者作為觀察研究對(duì)象，同時(shí)選擇健康人群為對(duì)照組。探討烏魯木齊地區(qū)漢族MTHFR基因多態(tài)性位點(diǎn)分布頻率，H型高血壓患者與C677T位點(diǎn)TT基因型顯性突變頻率，Hcy與血壓、葉酸的相關(guān)性?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年1月1日-12月31日在筆者所在醫(yī)院連續(xù)住院且確診為H型高血壓病的患者124例作為觀察組進(jìn)行長(zhǎng)期回顧性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者符合中國(guó)高血壓防治指南（2010版）中高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)空腹血清Hcy≥10 μmol/L；無(wú)心、肝、腎功能衰竭，腫瘤及感染性疾?。环抢^發(fā)性高血壓；無(wú)影響檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的其他生理生化指標(biāo)指征。排除標(biāo)準(zhǔn)：急慢性感染性疾?。粐?yán)重血液?。唤?個(gè)月內(nèi)服用葉酸、維生素B12和影響維生素代謝的藥物如甲氨蝶呤、煙酸、苯妥英鈉等。另選取同期健康定期體檢者120例作為對(duì)照組。對(duì)照組血壓均正常；Hcy及葉酸檢測(cè)結(jié)果在參考值范圍內(nèi)；肝功、腎功、血脂、血糖等生化指標(biāo)正常；無(wú)心腦血管系統(tǒng)疾病。觀察組和對(duì)照組均確定為烏魯木齊地區(qū)常住小區(qū)居民，族別全部為漢族。

1.2 一般資料收集

根據(jù)制定的入選、排除標(biāo)準(zhǔn)選擇調(diào)查研究對(duì)象進(jìn)入制定研究隊(duì)列。于首次入院時(shí)記錄及咨詢查閱病歷記錄，收集研究對(duì)象的一般資料，包括族別、性別、年齡、收縮壓、舒張壓、Hcy、葉酸等指標(biāo)。根據(jù)需要同時(shí)收集其基礎(chǔ)疾病及遺傳病史相關(guān)資料。

1.3 標(biāo)本采集

對(duì)上述兩組研究人群，采集3～5 ml清晨空腹時(shí)靜脈血，用抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀抗疑，充分與血液混勻，標(biāo)本采集獲取后當(dāng)天如不能及時(shí)測(cè)定，迅速將其置于-80 ℃處保存?zhèn)溆谩Ｓ煤蛛x膠或促凝劑的采血管抽患者空腹靜脈血4～5 ml，顛倒8次，放置30 min，離心10 min，離心力1 700g，EDTA抗凝血檢測(cè)MTHFRC677T基因位點(diǎn)。非抗凝血測(cè)定Hcy及葉酸。

1.4 儀器與試劑基因測(cè)定

儀器為PCR基因擴(kuò)增儀（江蘇常州市天隆科技有限公司產(chǎn)品），MTHFRC677T基因檢測(cè)試劑盒使用陜西省西安市西安全磁納米生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Hcy測(cè)定：儀器為全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼AU680型），試劑盒使用山東三維試劑公司產(chǎn)品。葉酸測(cè)定：儀器使用化學(xué)發(fā)光分析儀（羅氏公司E602型），試劑盒采用羅氏公司配套產(chǎn)品，批號(hào)432928。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 MTHFRC677T基因檢測(cè) 檢測(cè)項(xiàng)目為MTHFRC677T位點(diǎn)。樣品為2 ml EDTA抗凝血，將收集到的2 ml EDTA抗凝血，通過(guò)添加樣本稀釋液，促進(jìn)了血液樣本中DNA的釋放，PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)等位MTHFRC677T基因位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)和標(biāo)記，利用等位基因特異性，PCR方法擴(kuò)增獲得的基因片段，樣品通過(guò)側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)方法，實(shí)現(xiàn)了MTHFRC677T基因多態(tài)性的檢測(cè)。具體設(shè)置參數(shù)及操作方法參照PCR擴(kuò)增儀及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.2 Hcy測(cè)定 將分離的血清使用貝克曼AU680全血自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑使用山東三維循環(huán)酶法試劑盒，按照儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置參數(shù)，按儀器操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)定Hcy。

1.5.3 血清葉酸測(cè)定 將測(cè)定Hcy分離的血清，使用羅氏E602全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀，廠家配套試劑盒（批號(hào)E602號(hào)432978），按試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置參數(shù)，按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)定葉酸。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將收集的原始數(shù)據(jù)，使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，采用成組設(shè)計(jì)資料進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 質(zhì)量控制

所使用的儀器每年均進(jìn)行一次計(jì)量檢定，儀器均為合格。所用試劑都有注冊(cè)證。Hcy及葉酸項(xiàng)目分別參加了自治區(qū)及國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心室向質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，成績(jī)均為合格。測(cè)定樣品時(shí)均做了室內(nèi)質(zhì)控，室內(nèi)質(zhì)控均在控時(shí)方可檢測(cè)樣品。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別及年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），觀察組收縮壓、舒張壓、體質(zhì)指數(shù)及Hcy均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型頻率比較

MTHFR序列基因的多態(tài)性有三類，兩組人群經(jīng)過(guò)C677T位點(diǎn)基因檢測(cè)后，均確定為非TT（CC、CT）和TT三種基因型，觀察組TT基因型頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型頻率比較 例（%）

2.3 兩組MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型指標(biāo)比較

觀察組MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型Hcy水平、收縮壓、舒張壓均高于對(duì)照組，葉酸濃度低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型指標(biāo)比較 （±s）

表3 兩組MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型指標(biāo)比較 （±s）

組別 Hcy（μmol/L）葉酸（μg/L）收縮壓（mm Hg）舒張壓（mm Hg）觀察組（n=43） 20.9±2.6 4.8±1.7 150.6±3.1 99.2±2.7對(duì)照組（n=25） 11.6±1.9 16.9±2.1 109.1±2.9 78.5±2.4 t值 31.815 -49.544 107.908 63.222 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 Hcy與葉酸、血壓三者之間的相關(guān)性

2.4.1 Hcy與葉酸的相關(guān)性 通過(guò)分析MTHFRC677T多態(tài)基因TT型患者Hcy與葉酸相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，Hcy與葉酸呈負(fù)相關(guān)，Hcy濃度顯著升高，而葉酸濃度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，相關(guān)系數(shù)r=-0.991，r2=0.982，P=0.000，回歸方程為Y=1.612-0.99X，見(jiàn)圖1。

圖1 Hcy與葉酸相關(guān)性

2.4.2 Hcy與收縮壓的相關(guān)性 通過(guò)處理MTHFRC677T多態(tài)基因TT型患者Hcy與收縮壓相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，Hcy與收縮壓呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.997，r2=0.994，P=0.000，回歸方程為Y=2.031+88.716X，見(jiàn)圖2。

圖2 Hcy與收縮壓相關(guān)性

2.4.3 Hcy與舒張壓的相關(guān)性 與收縮壓相同，在H型高血壓MTHFRC6677T位點(diǎn)TT基因型患者中，Hcy與舒張壓呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.987，r2=0.974，P=0.000，回歸方程為Y=1.915+49.793X，見(jiàn)圖3。

圖3 Hcy與舒張壓相關(guān)性

3 討論

MTHFRC677T基因多態(tài)性為第677位點(diǎn)突變，它是目前發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的基因突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)的變化是堿基胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置換，這種功能性的突變直接影響MTHFR酶的活性的耐熱性。該位點(diǎn)突變有3種基因型，野生型CC，雜合型CT，純合突變型TT。MTHFR基因是葉酸代謝過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶，與同型半胱氨酸代謝也有關(guān)[4]。其具有多種基因的多態(tài)性，目前對(duì)C677T位點(diǎn)研究較多。MTHFRC677T多態(tài)性純合（TT）基因型具有血清高Hcy與低葉酸水平[5]。TT型基因型H型高血壓患者比例高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。

Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中的一個(gè)中間物質(zhì)，影響Hcy代謝的主要因素有環(huán)境和遺傳。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明Hcy是心及血管系統(tǒng)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞。Hcy水平升高的高血壓稱H型高血壓。血清Hcy在體內(nèi)是由甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成的。在人體內(nèi)，甲硫氨酸代謝不正常會(huì)導(dǎo)致Hcy升高。Hcy水平高，腦血管及神經(jīng)損傷程度就高。有研究報(bào)道TT基因型是H型高血壓發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

高Hcy血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切關(guān)系，而H型高血壓的兩大危險(xiǎn)因素，即高血壓與高Hcy血癥，都是心腦血管系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)因素。我國(guó)有75%的原發(fā)性高血壓屬于H型高血壓，早發(fā)現(xiàn)并開(kāi)展具有針對(duì)性的預(yù)防和治療措施是當(dāng)務(wù)之急[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組TT基因型頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在TT基因型患者中，血壓與Hcy呈正相關(guān)，與葉酸呈負(fù)相關(guān)，Hcy與葉酸呈相關(guān)。葉酸是Hcy體內(nèi)代謝過(guò)的重要底物，參與Hcy的甲基化過(guò)程。由于個(gè)體遺傳差異因素存在，MTHFR基因發(fā)生突變后就會(huì)導(dǎo)致對(duì)葉酸的利用率下降，有文獻(xiàn)報(bào)道，葉酸是合成核酸必不可少的元素之一，MTHFR基因多態(tài)性是葉酸代謝障礙發(fā)生的重要因素[8-11]。目前普遍認(rèn)為降低Hcy最有效的途徑是補(bǔ)充葉酸，臨床應(yīng)用葉酸對(duì)于防治H型高血壓具有顯著療效?？蓽?zhǔn)確、安全控制疾病[12]。

綜上所述，在H型高血壓患者中，MTHFRC677T多態(tài)性TT基因型頻率高于健康人，具有高Hcy、高血壓、低葉酸的特點(diǎn)。此類患者，可補(bǔ)充葉酸，用于降低Hcy，防治H型高血壓。