張軼華，田曉彤，孫 婷，高燕霞，李 揮

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050200）

甘草酸二銨是從甘草中分離、篩選的主要活性成分甘草酸的二銨鹽，具有非特異性抗炎、抗過(guò)敏、穩(wěn)定溶酶體膜及免疫調(diào)節(jié)作用，其抗病毒作用尤為突出。甘草酸二銨有2 個(gè)18 位差向異構(gòu)體，雖然二者的分子結(jié)構(gòu)僅18 位手性碳原子構(gòu)型不同，但其在理化性質(zhì)、藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、不良反應(yīng)等方面均存在差異，且分離測(cè)定存在一定困難?，F(xiàn)同時(shí)測(cè)定2 個(gè)差向異構(gòu)體的方法有薄層色譜（TLC）法和氣相色譜（GC）法，其中 TLC 法靈敏度太低，而GC 法需要復(fù)雜的衍生化。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)差向異構(gòu)體進(jìn)行分析［1］，雖有高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定甘草酸差向異構(gòu)體的報(bào)道，但這些方法［2－5］耐用性較差。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定甘草酸二銨制劑中18 α甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨含量的HPLC 法，為深入研究這2 個(gè)差向異構(gòu)體的區(qū)別提供了定性、定量依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，包括四元低壓梯度泵、全自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和紫外檢測(cè)器（美國(guó)Dionex 公司）；XPR26 ／A 型電子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）。

1.2 試藥

18 α 甘草酸二銨對(duì)照品（a 廠，批號(hào)為 120703，含量為 99.0% ）；18 β 甘草酸 二銨對(duì)照品 （a 廠，批 號(hào)為130106，含量為 99.5%）；甘草酸二銨膠囊（a 廠，批號(hào)分別為 100411，100412，100413）；注射用甘草酸二銨（b 廠、批號(hào)為 100131，c 廠、批號(hào)分別為 091103，100603，d 廠、批號(hào)為 110501，e 廠、批號(hào)分別為 1008213 －2，0909215 － 2，0810203 －1）；甘草酸二銨注射液（a 廠、批號(hào)分別為1003271，1004031，1004241，f 廠、批號(hào)為10060715，g 廠、批號(hào)分別為 0908021，1006131，h 廠、批號(hào)為 120111，i 廠、批號(hào)為 310060801，j 廠、批號(hào)分別為 08120601，10091801，10091802，k 廠 、批 號(hào) 為089131101，l 廠、批號(hào)為 090301）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水 －60% 高氯酸溶液（48 ∶0.5，V ／ V，用氨水調(diào)pH 至 8.0） － 甲醇（48 ∶52，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

稱(chēng)取18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨對(duì)照品各25 mg，精密稱(chēng)定，置同一25 mL 容量瓶中，加甲醇－水（50 ∶50，V ／ V）溶解并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取膠囊劑型樣品10 粒，另2 種劑型樣品各5 瓶，內(nèi)容物混勻，精密稱(chēng)?。咳。┘s相當(dāng)于甘草酸二銨25 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇 － 水（50 ∶50，V ／ V）溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。取3 種劑型樣品的輔料，以甲醇－水（50 ∶50，V ／ V）溶解制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。理論板數(shù)以18α 甘草酸二銨、18β 甘草酸二銨峰計(jì)均大于1 500。分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系與檢測(cè)限考察：用流動(dòng)相稀釋混合對(duì)照品溶液，制成質(zhì)量濃度分別為 1.0，0.5，0.3，0.1，0.05，0.01，0.005 mg ／mL 的系列混合對(duì)照品溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣 20 μL，記錄色譜圖。分別以 18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，mg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y1＝ 37.826 X1＋ 0.737（r ＝ 0.999 7，n ＝ 7），Y2＝49.436X2＋0.248（r ＝0.999 3，n ＝7）。結(jié)果表明，18α甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨的質(zhì)量濃度均在0.005 ～1.0 mg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比（S ／ N）＝ 3 計(jì)算 18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸二銨的檢測(cè)限，結(jié)果分別為 0.056 mg ／mL 和 0.082 mg ／mL。

圖1 高效液相色譜圖1.18 α － glycyrrhizic acid 2.18 β － glycyrrhizic acidA.Mixed reference solution B － D.Test solution（the batch numbers are 100411，100131，1003271）E.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗(yàn)：分別取混合對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨峰面積的 RSD 分別為0.42%和 0.60%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取不同劑型樣品（批號(hào)分別為100411，0909215 －2，10091801），分別按 2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置 0，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果3 批樣品 中 的 RSD 分 別 為 0.56% 和 0.63% ，0.49% 和0.59%，0.62%和 0.69%（n ＝5），表明供試品溶液室溫下放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取不同劑型（批號(hào)分別為100411，0909215 － 2，10091801）適量，分別按 2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果 3 批樣品中，18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸二銨含量平均值分別為 67.33% 和 33.72% ，66.32% 和32.98% ，67.25% 和 32.25% ，RSD 分別為 0.26% 和0.43% ，0.25% 和 0.48% ，0.61% 和 0.38% （n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別取已知18α 甘草酸二銨和18β甘草酸二銨含量的不同劑型樣品（批號(hào)分別為100411，100131，1003271）各 9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算2 種甘草酸異構(gòu)體含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1 至表3。

表1 甘草酸二銨膠囊加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate Capsules（n ＝ 9）

表2 注射用甘草酸二銨加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate for Injection（n ＝ 9）

2.4 樣品含量測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 甘草酸二銨注射液加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.3 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate Injection（n ＝ 9）

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.4 Content determination of 18 α － glycyrrhizic acid and 18 β －glycyrrhizic acid in the samples（%）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

預(yù)試驗(yàn)中，流動(dòng)相考察了1%冰醋酸－甲醇，3%冰醋酸－甲醇－四氫呋喃，3%冰醋酸－乙腈－四氫呋喃和3%冰醋酸－乙腈－四氫呋喃（用氨水調(diào)pH 至8.0），結(jié)果18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨均不能達(dá)到完全分離。在流動(dòng)相為水－60%高氯酸溶液（48 ∶0.5，V ／ V，用氨水調(diào) pH 至 8.0） － 甲醇（48 ∶52，V ／ V）時(shí)，18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸二銨完全分離，檢測(cè)出的雜質(zhì)峰最多，且雜質(zhì)分離效果最好。

3.2 18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸的組成比例

除f 企業(yè)注射液劑型中僅有18 β 甘草酸二銨外，其余廠家不同劑型樣品均為18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨共存，比例為 2 ∶1 ～ 7 ∶1 不等。甘草酸二銨提取自中藥甘草，2 種18 位差向異構(gòu)體的比例不易控制，且由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)差向異構(gòu)體的比例進(jìn)行要求，故各廠家制劑中二者的組成也不盡相同。已有文獻(xiàn)報(bào)道，不同比例的18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨制劑藥理作用也不同［6－10］，因此亟須制訂可行的方法控制其含量。