吳柳松，徐洪波，何 英，陳 艷

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 小兒內(nèi)二科，貴州 遵義 563099)

手足口病(Hand,foot and mouth disease，HFMD)是一種季節(jié)性發(fā)作，傳染性極強(qiáng)的兒童急性傳染病，最為常見的由EV71和CA16兩種腸道病毒引起，常在幼兒園等學(xué)齡前兒童中爆發(fā)[1]。部分HFMD患兒可并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、呼吸道感染和心肌炎等；若不干預(yù)可迅速發(fā)展至多器官功能障礙甚至死亡，嚴(yán)重危害兒童的身體健康。已經(jīng)證實(shí)，宿主基因遺傳背景在HFMD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，特別是干擾素刺激基因(IFN stimulated genes,ISGs) SNP與HFMD的易感性和臨床表型相關(guān)[2]，在分子水平上研究疾病遺傳易感性機(jī)制是目前HFDM主要研究方向之一。

2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶1(2’-5’oligoadenylates synthesis1,OAS1)，是一種由干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白，具有激活潛在性RNA酶活性，在降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促進(jìn)病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡等方面發(fā)揮重要作用[3]。OAS1也是細(xì)胞信號(hào)通路中對(duì)細(xì)胞和環(huán)境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)的重要激酶[4]，參與機(jī)體免疫性反應(yīng)、抗病毒感染以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生理病理活動(dòng)[5]。有研究報(bào)道，機(jī)體OAS1基因的表達(dá)與免疫性以及病毒性感染疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因而極具臨床診療推廣應(yīng)用的前景[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)OAS1基因多個(gè)SNP可能對(duì)丙型肝炎、SARS等病毒感染性疾病的轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生重要影響[7]。OAS1基因SNPs可調(diào)節(jié)OAS1的表達(dá)水平和酶活性，從而潛在地影響對(duì)病毒性疾病的易感性和嚴(yán)重性[8]。本研究選擇了兩種與病毒感染相關(guān)的OAS1 SNP位點(diǎn)(rs10774671和rs2660)，探討OAS1基因這兩個(gè)位點(diǎn)在HFMD中的分布情況，并分析其對(duì)HFMD易感類型、疾病進(jìn)展、病情嚴(yán)重程度以及轉(zhuǎn)歸預(yù)后性的影響，為兒童HFMD的早期篩查和診斷治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取于2014年12月至2019年12月在我院住院治療的HFMD患兒340例，其中男性患兒195例，女性患兒145例，中位年齡2歲5個(gè)月，診斷均符合我國(guó)衛(wèi)建委制定《手足口病診療指南(2010版)》。另外以同期在我院體檢健康的兒童120例作為對(duì)照組，其中64例男性兒童，56例女性兒童，中位年齡2歲1個(gè)月；上述病例組及對(duì)照組均于住院或門診當(dāng)日采集外周靜脈血5 mL，監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。收集所有患兒的臨床資料包括年齡、性別、病毒核酸檢測(cè)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、診治過(guò)程、預(yù)后轉(zhuǎn)歸以及出院隨訪等。

1.2 病例分組 根據(jù)不同臨床表現(xiàn)以及病情輕重，分為普通或輕癥手足口病(nHFMD)，重癥手足口病(sHFMD)；根據(jù)患兒通過(guò)血液腸道病毒核酸檢測(cè)證實(shí)為EV71或CA16不同病原感染情況，又分為EV71組和CA16組。nHFMD：主要癥狀為發(fā)熱，并伴有手、足、口、臀等部位出疹，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀。部分病例僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎，個(gè)別病例可無(wú)皮疹。sHFMD：表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者心肺功能損傷，隨病情進(jìn)展可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、循環(huán)障礙等，體征可見腦膜刺激征，腱反射減弱或消失；MRI顯示有腦部病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料收集不完整的病例；②在入院時(shí)被診斷患有其他病毒感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾病患者；③未檢測(cè)到EV71或CA16病原核酸的患者。

1.3 儀器與試劑 DNA提取試劑盒以及PCR試劑盒購(gòu)自Tiangen生物技術(shù)有限公司；SNP probe/primer mix 美國(guó)ABI公司；TaKaRa梯度PCR儀(大連TaKaRa公司)；AABI Prism 377全自動(dòng)測(cè)序儀購(gòu)于美國(guó)ABI Prism公司；ChemiDoc型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；超微量分光光度計(jì)(德國(guó)implen公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司)。

1.4 基因位點(diǎn)PCR擴(kuò)增 基因組DNA提?。簢?yán)格按照試劑盒說(shuō)明提取基因組DNA，用ImplenNanoPhotorneter測(cè)試樣本DNA濃度及純度，置于-20 ℃保存。用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)OAS1基因位點(diǎn)引物，引物序列見表1。

表1 OAS1基因rs10774671和rs 2660的序列引物

PCR反應(yīng)：依照PCR試劑盒說(shuō)明，選擇25 (L反應(yīng)體系。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃ 3 min，最后4 ℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物酶切分析、回收純化及測(cè)序 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，分別用MluⅠ以及NotⅠ內(nèi)切酶(NEB公司)進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收并純化PCR產(chǎn)物后，采用ABI PRISM377型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序分析，所測(cè)定的DNA序列通過(guò)國(guó)際互連網(wǎng)查詢GenBank，應(yīng)用DNAstar軟件及Cromse進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 HFMD患兒一般資料及臨床特征 本研究共收集EV71感染178例，其中男101例，女77例，中位年齡2.36(1.10～2.50)歲；其中nHFMD 104例，sHFMD 74例。CA16感染患兒162例，其中男94例，女68例，中位年齡2.78(1.24～2.93)歲；其中nHFMD 83例，nHFMD 79例。正常對(duì)照組120例，男64例，女56例，中位年齡1.20(1.05～1.95)歲。

分析患兒臨床癥狀及特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EV71感染的HFMD患兒發(fā)熱持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，臨床癥狀一般較重，多數(shù)有累及神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，進(jìn)展為重癥手足口病患兒比例多；但口腔黏膜損害程度相對(duì)較輕，各部位皮疹相對(duì)減少。另外，CA16及EV71感染的HFMD患兒細(xì)胞因子IFN-γ(干擾素γ)、Ferritin(鐵蛋白)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)以及CRP(C反應(yīng)蛋白)的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在CA16、EV71感染的HFMD患兒之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；其他指標(biāo)如性別、年齡、ALT(轉(zhuǎn)氨酶)、CK(磷酸激酶)、CK-MB(磷酸激酶同工酶)等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，見表2)。

表2 手足口病患兒的臨床特征分布

續(xù)表

2.2 HFMD患兒OAS1 rs10774671基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分布 OAS1 rs10774671基因位點(diǎn)測(cè)序圖如圖1，分析該位點(diǎn)SNP在HFMD患兒中的分布情況，結(jié)果顯示，CA16組GG基因型頻率和G等位基因頻率分布均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；EV71組各基因型頻率和等位基因頻率則與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.865、0.830，見表3)。

如果該位點(diǎn)是一個(gè)單峰波形且相應(yīng)的堿基是G或A，則該基因型是GG(A)或AA(B)純合，如果該位點(diǎn)是一個(gè)雙峰重疊波形相應(yīng)的堿基A和G，基因型為AG雜合(C)。

表3 手足口病中OAS1基因rs10774671基因型的分布和等位基因頻率[n(%)]

2.3 HFMD患兒OAS1 rs 2660基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分布 OAS1 rs 2660基因位點(diǎn)測(cè)序圖如圖2，分析OAS1 rs 2660基因位點(diǎn)SNP在HFMD患兒中的分布情況，結(jié)果顯示，EV71組AG基因型頻率和G等位基因頻率分布顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；CA16組各基因型頻率和等位基因頻率的分布則與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.317、0.265，見表4)。

表4 手足口病患兒OAS1基因rs 2660基因型分布及等位基因頻率[n(%)]

如果該位點(diǎn)是一個(gè)單峰波形，且相應(yīng)的堿基是G或A，則該基因型是GG(A)或AA(B)型，如果該位點(diǎn)是一個(gè)雙峰重疊波形，且相應(yīng)的堿基A和G，基因型是AG型(C)。

2.4 OAS1基因rs10774671、rs2660位點(diǎn)與HFMD患兒嚴(yán)重性的關(guān)系 結(jié)果顯示，OAS1基因rs10774671位點(diǎn)的基因型分布在CA16感染的病例中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032)，且輕癥HFMD患兒攜帶GG基因型所占的比例較多，占54.31%(63/116)。而該位點(diǎn)的基因分布在EV71感染的病例中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.936)。OAS1基因rs2660位點(diǎn)基因型分布在EV71感染的病例中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004)，且重癥HFMD患兒攜帶AG基因型所占的比例較多，占67.37%(64/95)，而該位點(diǎn)的基因分布在CA16感染的病例中則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.384，見表5)。

表5 OAS1基因rs10774671和rs 2660基因型在手足口病患兒輕型和重癥中的分布[n(%)]

2.5 OAS1基因 rs10774671、rs2660位點(diǎn)與HFMD患兒性別的關(guān)系 分析比較不同性別的HFMD患兒OAS1 基因不同位點(diǎn)各基因型的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OAS1基因 rs10774671位點(diǎn)AG、GG基因型男童比例分布均顯著多于女童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)；而OAS1 rs 2660不同基因型在HFMD患兒性別分布上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.508，見表6)。

表6 OAS1基因rs10774671和rs 2660基因型在手足口病患兒性別中的分布[n(%)]

2.6 OAS1基因rs10774671、rs2660位點(diǎn)不同基因型之間IFN-γ的表達(dá)水平 分析比較IFN-γ分別在OAS1基因不同位點(diǎn)基因型的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，攜帶OAS1基因rs10774671、rs2660 GG基因型的患兒均比AA基因型和AG基因型的患兒IFN-γ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶rs2660 GG基因型的IFN-γ水平比攜帶rs10774671 GG基因型明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017，見圖3)。

圖3 OAS1基因rs10774671和rs2660位點(diǎn)不同基因型之間IFN-γ的表達(dá)水平

3 討論

HFMD是一種兒童最常見的急性傳染病，該病可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，并迅速進(jìn)展為重癥或危重癥，危及患兒生命。因此，早期識(shí)別重癥患兒，及早準(zhǔn)確診斷，及時(shí)開展有效的救治以阻斷或延緩疾病進(jìn)展是降低患兒病死率的重要措施。HFMD主要由腸道病毒EV71和CA16引起，其臨床癥狀特征表現(xiàn)復(fù)雜多變。本研究發(fā)現(xiàn)，由EV71感染患兒比由CA16感染患兒發(fā)熱持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，臨床癥狀一般較重，多數(shù)有累及神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，并且重癥手足口病患兒比例多；但口腔黏膜損害程度則相對(duì)較輕，皮疹相對(duì)減少，少數(shù)EV71感染患兒甚至未發(fā)現(xiàn)皮疹，常出現(xiàn)漏診或誤診而貽誤最佳治療時(shí)機(jī)。另外，多數(shù)患兒及家長(zhǎng)都無(wú)法及時(shí)準(zhǔn)確地主訴癥狀特征，且查體患兒一般不太配合。因此，需要從其他角度出發(fā)尋找易于準(zhǔn)確鑒別不同類型的HFMD檢測(cè)指標(biāo)。

OAS是一組由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒酶類家族，在宿主抵抗病毒感染中起著關(guān)鍵作用[9]。OAS1基因的SNPs可調(diào)節(jié)OAS1的表達(dá)水平和酶活性，潛在地影響一些病毒性疾病的易感性，并與疾病嚴(yán)重性之間存在關(guān)聯(lián)[5]。特別是OAS1基因中的兩個(gè)功能性SNPs(rs2660和rs10774671)與肝炎病毒[10]、流感病毒[11]、重癥急性呼吸綜合征病毒[12]等多種病毒相關(guān)性疾病的病毒復(fù)制有關(guān)；這提示OAS1基因這兩個(gè)SNP位點(diǎn)可能也能夠影響HFMD的易感性、嚴(yán)重性和轉(zhuǎn)歸情況。

rs10774671位于OAS1基因第5號(hào)內(nèi)含子中，該位點(diǎn)決定了相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄剪接以及OAS1蛋白及亞型的酶活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA16組該位點(diǎn)GG型基因和G等位基因頻率分布均顯著高于正常對(duì)照組(P=0.000)；這表明，攜帶OAS1基因rs10774671位點(diǎn)GG基因型的患兒更易感染CA16，另外該基因型患兒多數(shù)為輕癥HFMD。研究證實(shí)，OAS1 rs10774671位點(diǎn)的多態(tài)性是由于剪接位點(diǎn)不同造成的，并影響該酶催化活性，等位基因?yàn)镚時(shí)，將導(dǎo)致OAS1轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA剪接變異體的出現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)更高的酶活性，OAS1合成增多，更能有效地抑制病毒復(fù)制和病毒蛋白的合成；因此，該基因型患兒癥狀均較輕，為輕癥HFMD或普通HFMD，一般不會(huì)進(jìn)展為重癥或危重癥。另外研究還發(fā)現(xiàn)，此基因位點(diǎn)上攜帶GG基因型的男性兒童多于女性，是否與本地區(qū)HFMD患兒發(fā)病男童多于女童有關(guān)，其具體原因尚需進(jìn)一步深入研究。

rs2660位于OASl基因3’-UTR區(qū)域的exon 7上，該位點(diǎn)對(duì)病毒感染疾病的轉(zhuǎn)歸可能存在影響。本研究發(fā)現(xiàn)，EV71組OAS1 rs2660位點(diǎn)AG型基因頻率和G等位基因頻率分布顯著高于正常對(duì)照組(P=0.001)，這表明，攜帶AG基因型兒童更易感染EV71；另外，該基因型患兒多數(shù)為重癥HFMD。研究證實(shí)，當(dāng)rs2660等位基因G變A時(shí)編碼的氨基酸發(fā)生改變(p48：Gly-Arg，p52：Arg-Lys)，其可能造成OAS1單體三維構(gòu)象改變，從而影響了OASl四聚體活性，OAS1合成減少，失去了抑制病毒復(fù)制和病毒蛋白的合成的功能；國(guó)內(nèi)還有研究顯示，攜帶OAS1 rs2660 AG基因型的兒童在EV71感染后更可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[13]。因此，該基因型患兒癥狀均較重，一般為重癥或危重癥HFMD，需要十分警惕，該類患兒應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)，及時(shí)治療。因此，OAS1基因rs2660位點(diǎn)AG基因型可能與重癥HFMD相關(guān)。

另外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，攜帶OAS1基因rs10774671、rs2660 GG基因型的患兒均比AA基因型和AG基因型的患兒IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)，攜帶rs2660 GG基因型的IFN-γ水平較攜帶rs10774671 GG基因型也明顯升高(P=0.017)。IFN-γ則是機(jī)體抵抗病毒感染先天性免疫中的重要細(xì)胞因子，參與機(jī)體抗病毒、抗細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多種細(xì)胞重要生理病理活動(dòng)，較高濃度IFN-γ有利于機(jī)體啟動(dòng)免疫功能抗病毒反應(yīng)和病毒清除[14]。OAS1基因rs10774671和rs2660 GG基因型與OAS1酶活性高低存在相關(guān)，從而影響內(nèi)源性IFN-γ在抗病毒先天性免疫中的功能；因此，這些位點(diǎn)均與HFMD易感性以及嚴(yán)重性有關(guān)。這提示IFN-γ可能是通過(guò)影響OAS1基因的表達(dá)以及蛋白酶活性從而參與了手足口病的免疫發(fā)病，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究表明，攜帶OAS1 rs10774671位點(diǎn)GG基因型兒童更易感染CA16，與輕癥HFMD相關(guān)；攜帶OAS1 rs2660位點(diǎn)AG基因型兒童更易感染EV71，與重癥HFMD相關(guān)；IFN-γ可能參與了手足口病的免疫發(fā)病。