喬 鵬， 任昭輝， 崔日男, 林雨晟，于大鵬, 張守榮, 李 旭, 劉鵬飛*

(1.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司延吉卷煙廠；2.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司：吉林 延吉 133001；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地，河南 鄭州 450002)

煙堿作為煙葉的特征成分不僅具有調(diào)節(jié)吸食者情緒的作用，而且是廣譜殺菌劑和殺蟲劑。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，煙堿的檢測(cè)方法已從最初的硅鎢酸重量法[1]，發(fā)展到后來的紫外分光光度法[2-5]、連續(xù)流動(dòng)分析法[6]、氣相色譜法(GC、GC-MS)[7-9]、液相色譜法(HPLC)[10-12]等。每種方法都有其適合的應(yīng)用場(chǎng)景、需求和價(jià)值,也各具優(yōu)缺點(diǎn)，如連續(xù)流動(dòng)分析法、GC-MS、HPLC法檢測(cè)精確度高，但是儀器較為昂貴；硅鎢酸重量法設(shè)備簡(jiǎn)單但操作繁瑣、步驟多且精確度較低。而紫外分光光度法操作較為簡(jiǎn)單，設(shè)備便宜，精確度較高，廣泛應(yīng)用于教學(xué)和實(shí)踐中。

1977年原輕工業(yè)部煙草所推薦了用紫外分光光度法測(cè)煙堿。1982年王秀芝等[2]在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充了待測(cè)液的最適濃度、萃取時(shí)間等，并且修訂了檢測(cè)煙堿的計(jì)算公式；同年，孫瑞申等[3]又進(jìn)行了細(xì)化和完善。前輩們得出的最重要的結(jié)論是驗(yàn)證和完善了煙堿含量計(jì)算公式，即

細(xì)讀前輩們的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用該公式的前提和相關(guān)注意事項(xiàng)有：1) 原公式是以硅鎢酸重量法檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)制定，1.059是與該方法對(duì)比后的校正系數(shù)；2) 處理方法為蒸餾法，即把樣品、水、氯化鈉、氫氧化鈉一起放入燒瓶中加熱蒸餾，餾分經(jīng)硫酸吸收后進(jìn)行檢測(cè)；3) 溶液吸光度在0.167～0.651，其對(duì)應(yīng)煙堿濃度為5～18 mg/L；4) 原公式的提出是基于假設(shè)雜質(zhì)對(duì)煙堿在259 nm處吸光度的干擾等于236 nm和282 nm處干擾形成梯形的中位線[4]。

在教學(xué)和實(shí)踐應(yīng)用中，該公式應(yīng)用較廣，但也存在一些瑕疵：1) 原公式的樣品處理方法為蒸餾法，而該方法操作繁瑣，因此在一些實(shí)際應(yīng)用時(shí)很容易被忽視而采用溶劑萃取法[13-16]，不同的處理方法其雜質(zhì)差異較大，原公式在此適用性存疑；2) 校正系數(shù)1.059以硅鎢酸重量法為基準(zhǔn)，現(xiàn)今可采用更精確的高效液相色譜法；3) 原公式以烤煙為原料，對(duì)其它類型煙葉的適用性未知。因此，該研究以高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果為基準(zhǔn)，采用更常用的溶劑萃取法進(jìn)行前處理，分別以4種不同類型煙葉即烤煙、白肋煙、雪茄煙、曬煙為對(duì)象嘗試對(duì)該公式進(jìn)行完善，以便為應(yīng)用者提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

烤煙(54個(gè)，產(chǎn)地云南、河南、江西、貴州、重慶)、曬紅煙(4個(gè)，產(chǎn)地吉林)、白肋煙(4個(gè)，產(chǎn)地湖北)和雪茄煙(15個(gè)，產(chǎn)地海南、四川)，共計(jì)77個(gè)。

煙堿(加拿大，TRC)；醋酸鈉、磷酸、三乙胺、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇(分析純，天津大茂)；乙腈、甲醇(色譜純，天津科密歐)。

電子天平(上海上平，精度0.000 1 g)，超聲儀(鄭州生元，SYU-10-300 DT)，pH計(jì)(上海豐控，F(xiàn)K-PH10)，液相色譜(日本島津，LC-20 A)，紫外可見分光光度計(jì)(上海元析，UV-5200)。

1.2 樣品紫外掃描

用紫外分光光度計(jì)對(duì)煙堿(乙腈溶解)、乙醇、甲醇、煙樣(5%甲醇萃取)在210 ～360 nm進(jìn)行掃描。

配制不同濃度煙堿溶液，在259 nm處考察吸光度線性范圍。

1.3 萃取溶劑對(duì)煙堿的影響

稱取100 mg粉碎后過40目篩的煙葉樣品(以下簡(jiǎn)稱樣品)，放入錐形瓶中，分別加入不同濃度的鹽酸、氫氧化鈉、氨水、甲醇的水溶液20 mL，震蕩萃取30 min，用磷酸或三乙胺溶液調(diào)節(jié)pH值至5左右(甲醇萃取液無(wú)須調(diào)節(jié)pH值)，過濾至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC檢測(cè)。

1.4 萃取時(shí)間對(duì)煙堿的影響

稱取100 mg樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分別萃取10、15、20、25和30 min，過濾至50 mL容量瓶中，定容，用于HPLC檢測(cè)。

1.5 紫外分光光度法檢測(cè)

稱取100 mg樣品，加20 mL 5%甲醇萃取30 min，過濾至50 mL容量瓶定容后得到樣品溶液。樣品溶液分成2份，1份用于液相色譜檢測(cè)，1份稀釋20倍后以水為對(duì)照用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為236、240、260、282 nm。

1.6 液相色譜法檢測(cè)

配制不同濃度煙堿標(biāo)品溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件：島津Shim pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A(90%甲醇+10%水，0.1%醋酸鈉，pH值6.8)，流動(dòng)相B(90%水+10%甲醇，10 ppm磷酸，pH值3.8)，流動(dòng)相B占4.5%，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用外標(biāo)法進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，數(shù)據(jù)用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行分析，用origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的紫外掃描

由圖1可知，煙堿最強(qiáng)吸收峰在259 nm處，谷底在236 nm處，大于282 nm后無(wú)吸收。而乙醇在小于268 nm時(shí)具有紫外吸收，因此，不能用含乙醇溶劑進(jìn)行萃取后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)煙堿含量。甲醇在大于240 nm時(shí)幾乎無(wú)紫外吸收，因此，可以用作萃取溶劑。對(duì)5%甲醇水溶液作為萃取劑得到的4種類型煙葉的萃取液進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)，各萃取液均在259 nm處有最強(qiáng)吸收。并且這4種樣品溶液的谷底均在240～242 nm，大于煙堿的谷底所處波長(zhǎng)236 nm。雪茄煙、白肋煙和曬紅煙樣品溶液的吸收曲線走勢(shì)較為一致，在大于276 nm后雪茄煙、白肋煙和曬紅煙溶液的吸光度均呈現(xiàn)緩慢下降走勢(shì)，而烤煙溶液吸光度在276～328 nm內(nèi)下降趨勢(shì)不明顯。

由表1可以看出，紫外吸收峰谷比值差異非常大，煙堿達(dá)到3.27，烤煙最小，為1.02，而3種晾曬煙比值較為接近，為1.22～1.27。

表1 煙堿、4種樣品溶液的紫外吸收峰谷比值

由圖2a、b可知，在煙堿濃度小于0.909 μg/mL(吸光度為0.047)和濃度大于128.424 μg/mL(吸光度2.088)，曲線有偏離趨勢(shì)。在中濃度范圍2.056(吸光度0.074)～116.080 μg/mL(吸光度1.935)其線性關(guān)系較好，R2為0.999 2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于前人研究結(jié)果[2,4]中的線性范圍0.167～0.671和0.2～0.8，線性范圍的大幅擴(kuò)展說明現(xiàn)今的紫外分光光度計(jì)性能有大幅提升。

2.2 萃取溶劑對(duì)煙堿的影響

煙堿是強(qiáng)極性的有機(jī)物，易溶于水和甲醇，該試驗(yàn)選取不同濃度的鹽酸、氫氧化鈉、氨水和甲醇考察不同溶劑的萃取效果(表2)。

由表2可知，不同濃度的甲醇溶液中煙堿含量總體高于氫氧化鈉溶液，與氨水和鹽酸萃取效果無(wú)顯著性差異。根據(jù)許燕娟等[17]的研究結(jié)果，堿性溶液的強(qiáng)度對(duì)煙堿萃取率有較大影響，相同濃度下氨水溶液比氫氧化鈉溶液檢測(cè)到的生物堿種類多。類似地，Li等[18]用不同濃度氨水萃取煙葉中的生物堿，發(fā)現(xiàn)6%氨水好于其它濃度，也好于氫氧化鈉溶液。綜合考慮到甲醇溶液相比氨水和鹽酸溶液有利于樣品溶液的儲(chǔ)存和液相色譜柱以及具有較好的抑菌性，因此，采用5%甲醇作為后續(xù)試驗(yàn)的萃取溶劑。

表2 4種不同萃取溶劑的煙樣中煙堿萃取率

2.3 萃取時(shí)間對(duì)煙堿萃取率的影響

超聲、微波等常用于輔助萃取試驗(yàn)，然而它們?cè)谔岣咻腿÷实耐瑫r(shí)，也會(huì)帶來更多雜質(zhì)，這對(duì)于采用紫外分光光度法檢測(cè)非常不利，因此，選擇較為溫和的常溫震蕩法進(jìn)行萃取。由表3中可以看出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取率升高，而在25、30 min時(shí)無(wú)顯著差異，為保險(xiǎn)起見采用30 min作為萃取時(shí)間。

表3 萃取時(shí)間對(duì)煙堿萃取率的影響

2.4 煙堿含量測(cè)定公式的探討與擬合

原公式以236和282 nm為梯形的中位線法推測(cè)雜質(zhì)在259 nm處的干擾。由圖1可以看出，由于雜質(zhì)的干擾，萃取液的紫外吸收谷底由煙堿的236 nm紅移至240～242 nm處，而與之等距離的是276～278 nm。但從圖1中可以看出，在波長(zhǎng)小于278 nm時(shí)，4種類型樣品溶液的紫外吸光度與波長(zhǎng)形成的斜率較大，為減小誤差而檢測(cè)279～282 nm處吸光度。因此，以240、259和282 nm的吸光度用于新公式的擬合。煙堿含量以HPLC法檢測(cè)結(jié)果為基準(zhǔn)。

從表4中吸光度與煙堿含量的相關(guān)性結(jié)果可以看出，煙堿含量與240 nm相關(guān)性接近顯著水平，這是因?yàn)闊焿A在240 nm有紫外吸收，但又有雜質(zhì)干擾造成的；與259 nm處吸光度相關(guān)性達(dá)到顯著水平，這正是采用該方法原理所在。煙堿與282 nm處的吸光度相關(guān)性較差，這是因?yàn)闊焿A在該處無(wú)吸收(圖1)，其吸光度是因?yàn)殡s質(zhì)的干擾。而樣品溶液在240、259和282 nm處的吸光度之間呈極顯著相關(guān)性，這恰好說明雜質(zhì)對(duì)這3個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度影響一致，這正是原公式建立的基礎(chǔ)。

表4 不同波長(zhǎng)吸光度與煙堿含量的相關(guān)性

以20個(gè)烤煙樣品在240、259和282 nm處的吸光度為自變量，以HPLC檢測(cè)煙堿含量為因變量用SPSS軟件擬合回歸得到擬合方程為:

C=(0.080 7+0.426 9×A259+ 0.473 9×A240-0.631 2×A282)V/m

式中,C為煙堿含量/%，A259，A240和A282分別為樣品溶液的吸光度，V為樣品溶液體積/L，m為煙樣質(zhì)量/g。

再分別以2個(gè)公式對(duì)剩余57個(gè)煙葉樣品煙堿含量進(jìn)行計(jì)算，然后分別將計(jì)算結(jié)果除以HPLC檢測(cè)結(jié)果，則比值越接近1說明檢測(cè)越準(zhǔn)確。由圖3可以看出，全部樣品的原公式計(jì)算結(jié)果與HPLC檢測(cè)結(jié)果的比值基本呈正態(tài)分布，且在0.75～1.25的部分占49.12%；而烤煙樣品的比值在0.75～1.25的占55.88%，集中度略有提升；對(duì)于晾曬煙樣品，其比值也呈正態(tài)分布，但集中度較烤煙低，0.75～1.25的僅占39.13%。全部樣品的擬合公式計(jì)算結(jié)果與HPLC檢測(cè)結(jié)果的比值基本呈正態(tài)分布，0.75～1.25的占61.40%，高于原公式；烤煙樣品的比值在0.75～1.25的占76.47%，集中度有大幅提升；對(duì)于晾曬煙樣品其集中度較低，比值在0.75～1.25也是僅占39.13%，但是比值在0.5～0.75和1.25～1.60的分別由17.39%、21.74%提升至26.09%、30.43%。可以看出，2個(gè)公式的結(jié)果均是烤煙集中度高于晾曬煙，這是因?yàn)椋?) 2種方法的建立基礎(chǔ)為烤煙，2) 晾曬煙的雜質(zhì)對(duì)吸光度的干擾有差別。

3 討論與結(jié)論

4種類型煙葉樣品的紫外掃描顯示，3種晾曬煙的圖形一致而與烤煙有差別，表現(xiàn)為峰谷比值前三者較為接近，以及吸收波長(zhǎng)大于276 nm后的走勢(shì)呈緩慢下降而烤煙的紫外吸收幾乎不變，說明不同煙草類型的雜質(zhì)對(duì)吸收的影響有所差異。通過對(duì)不同萃取溶劑的考察發(fā)現(xiàn)，甲醇、鹽酸和氨水萃取效率較高，選擇甲醇作為萃取溶劑，是因?yàn)檩^好的抑菌性，并且有利于樣品溶液的保存以及對(duì)色譜柱友好。

原公式建立的基礎(chǔ)是朗伯比爾定律即煙堿含量與吸光度成正比。但是在實(shí)際測(cè)定過程中，由于檢測(cè)儀器等的誤差，標(biāo)準(zhǔn)曲線或者擬合曲線一般呈線性關(guān)系而非正比關(guān)系[9,19]。另外，該試驗(yàn)紫外掃描圖和文獻(xiàn)[20]中均顯示煙堿在236 nm處有一定的紫外吸收，而不是無(wú)吸收，所以不能將236 nm處的吸光度全部作為雜質(zhì)。樣品溶液在240、259和282 nm處的吸光度之間存在極顯著相關(guān)性說明雜質(zhì)對(duì)這3處的吸光度影響較為一致，這正是2個(gè)公式建立的基礎(chǔ)。通過2個(gè)公式的計(jì)算結(jié)果與HPLC結(jié)果的比值分布可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于烤煙樣品，新擬合公式的精確度較原公式有大幅提升；而對(duì)于晾曬煙樣品則沒有明顯提升，這是因?yàn)?個(gè)公式的建立均是以烤煙為基礎(chǔ)而建立的，然而晾曬煙的雜質(zhì)與烤煙不一樣，這在紫外掃描圖中也有所反映。下一步將收集更多晾曬煙樣品，以建立更適用于它們的計(jì)算公式。