權(quán)赫根， 于楷力， 洪 國(guó)， 金英花， 全雪麗

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

目前為止曼陀羅研究主要集中在化學(xué)成分、藥理、醫(yī)學(xué)和環(huán)境修復(fù)方面[4-11]，也有種子萌發(fā)[12]及組織培養(yǎng)[13]方面的研究報(bào)道，尚缺少曼陀羅生殖生物學(xué)方面的內(nèi)容，且曼陀羅屬的很多野生資源未能在園藝或園林中得到充分利用。該試驗(yàn)采用常規(guī)石蠟切片法、TTC法對(duì)藥用植物曼陀羅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及雄配子體形成過程及其花粉活力進(jìn)行了研究，為曼陀羅屬植物生殖發(fā)育及雜交育種積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2018年4～12月在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院教育實(shí)踐基地進(jìn)行。4月初將種子溫水(約40 ℃)處理4～5 h后播種到溫室里，等幼苗長(zhǎng)到20 cm左右時(shí)，移栽到試驗(yàn)田。種植密度為50 cm×50 cm，定期觀察、采樣。

1.2 方法

1.2.1 曼陀羅開花習(xí)性調(diào)查

主要調(diào)查曼陀羅植物的現(xiàn)蕾期(大量的花蕾出現(xiàn))、始花期(開花數(shù)在20%左右)、盛花期(開花數(shù)在80%左右)、成熟結(jié)果期(結(jié)果數(shù)約80%)、枯萎期(不再有新果出現(xiàn))。

1.2.2 曼陀羅雄配子體發(fā)育研究

在曼陀羅盛花期，上午10:30分左右用剪子剪取不同大小的新鮮花朵，按花蕾長(zhǎng)度大小進(jìn)行分級(jí)。A：小于1.5 cm；B：1.5～2.0 cm；C：2.0～2.5 cm；D：2.5～3.0cm；E：3.0～4.0 cm；F：4.0～5.0 cm；G：5.0～6.0 cm；H：6.0～7.0 cm；I：7.0～8.0 cm；J：大于8.0 cm。對(duì)以上曼陀羅花朵進(jìn)行固定(FAA固定液)，石蠟切片法進(jìn)行切片、染色、樹膠封片后在顯微鏡下觀察解剖結(jié)構(gòu)。最后分析花蕾大小與花粉不同發(fā)育時(shí)期之間的相關(guān)性。

1.2.3 曼陀羅花粉活力測(cè)定研究及花粉粒大小

選取4個(gè)不同發(fā)育階段(A花瓣即將露出花萼，花蕾長(zhǎng)度4.5 cm左右；B花瓣已露出花萼，花蕾長(zhǎng)度6.0 cm左右；C花朵開放時(shí)期，花蕾長(zhǎng)度8.5～9.5 cm左右；D花朵萎蔫時(shí)期，花蕾長(zhǎng)度9.0 cm，圖1～2所示)的花粉，采用TTC法染色，測(cè)定其花粉活力。染成紅色的花粉為活力高，未染色的為無活力?；ǚ刍盍?被染花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100%。每個(gè)發(fā)育階段測(cè)定花粉活力，重復(fù)3次。通過Image J測(cè)量軟件測(cè)量成熟花粉粒大小。

傳統(tǒng)的節(jié)日和節(jié)俗歷史悠久，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，集中體現(xiàn)了中華傳統(tǒng)文化的核心價(jià)值，生動(dòng)展示了中國(guó)人豐富多彩的精神世界，是民族特色和民族個(gè)性的具體反映。 同時(shí)，它們與民眾生活密切相連，深具活力和影響力，是活態(tài)的傳統(tǒng)文化表現(xiàn)形式，并在世代傳承中起到加強(qiáng)血緣和社會(huì)紐帶、促進(jìn)團(tuán)結(jié)與文化認(rèn)同的作用。 它們記錄著中華民族數(shù)千年的歷史，凝聚了民眾的生活和情感，以全民參與的方式傳承文化血脈、提振民族精神、強(qiáng)化歷史記憶，具有深刻的意義和深遠(yuǎn)的影響。 絢麗多彩的節(jié)日，是我國(guó)人民代代傳承的珍貴文化，也是世界文明的瑰寶。 它們照亮了五千年的歷史，也照耀著未來的天空。

1.2.4 曼陀羅果實(shí)特性調(diào)查

在曼陀羅處于果實(shí)成熟的后期，選有代表性的10棵，調(diào)查其株高、單株果實(shí)數(shù)、單果重量、果實(shí)心皮數(shù)、單果種子數(shù)、果實(shí)大小、種子千粒重等。

2 結(jié)果與分析

2.1 曼陀羅開花習(xí)性調(diào)查

曼陀羅播種(4月初)后30 d,個(gè)別花蕾已經(jīng)出現(xiàn)，但花蕾期比較集中時(shí)期為播種后的60 d，即6～7月中旬，持續(xù)1個(gè)半月。始花期為7月中旬～8月初，持續(xù)半個(gè)月；盛花期為8月，持續(xù)一個(gè)月；成熟結(jié)果期為8月末～9月末，持續(xù)1個(gè)月；10月初開始進(jìn)入枯萎期，持續(xù)1個(gè)半月。

2.2 曼陀羅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程觀察

曼陀羅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程如圖3所示。

由造孢細(xì)胞發(fā)育形成的花粉母細(xì)胞在花粉囊內(nèi)呈半圓狀排列(圖3-1)，染色比較深，與其他細(xì)胞容易區(qū)分。初期花粉母細(xì)胞排列緊密，囊內(nèi)空間狹小，隨著花粉母細(xì)胞的繼續(xù)發(fā)育，即進(jìn)入減數(shù)分裂，花粉囊也隨著發(fā)育，囊內(nèi)空間也隨之變大(圖3-2～12)。進(jìn)入減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞體積變大，核也變大(圖3-3)，染色質(zhì)變成染色體，染色體排在細(xì)胞中間(圖3-4)，后期同源染色體分離(圖3-5)，均等移動(dòng)到細(xì)胞兩邊(染色體減半)，這時(shí)胞質(zhì)沒有分裂，不形成二分體，屬于同時(shí)型。兩邊的染色體又進(jìn)行分裂(進(jìn)行的是有絲分裂，圖3-6)，形成4個(gè)核(圖3-7)，核膜、核仁重新形成，細(xì)胞版形成，胞質(zhì)分裂，最終形成染色體減半的4個(gè)子細(xì)胞，即四分體時(shí)期(圖3-8)。四分體排列方式主要以四面體型為主(圖3-8)。

2.3 曼陀羅雄配子體形成觀察

四分體被胼胝質(zhì)酶溶解后，互相分離，形成小孢子，最初形態(tài)不規(guī)則，體積小(圖3-9)，繼續(xù)發(fā)育后，體積變大，核在細(xì)胞的中央，細(xì)胞壁形成，萌發(fā)孔慢慢體現(xiàn)(圖3-10)。進(jìn)一步發(fā)育后，核的位置發(fā)生變化，原本在細(xì)胞中央的核移到細(xì)胞的一邊，細(xì)胞內(nèi)形成大液泡，核進(jìn)入分裂期，3個(gè)萌發(fā)孔明顯(圖3-11)。核進(jìn)行分裂后形成2個(gè)核，進(jìn)入雙核期，進(jìn)一步發(fā)育后，一個(gè)核變成凸透鏡形狀，為精核，另一個(gè)核圓形，為營(yíng)養(yǎng)核，成熟的花粉粒為2-細(xì)胞型(圖3-12)。成熟的花粉粒表面有很多小毛刺，3個(gè)萌發(fā)孔。

2.4 曼陀羅花藥壁的發(fā)育

花粉母細(xì)胞時(shí)期花藥壁已經(jīng)分化形成，如表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，但此時(shí)不同層次之間細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖3-1～2)。母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期，花藥壁最內(nèi)層絨氈層迅速增大(圖3-3)。從減數(shù)分裂Ⅰ中期，到減數(shù)分裂Ⅱ末期，絨氈層細(xì)胞發(fā)育達(dá)到最大值(圖3-4～7)，四分體開始慢慢解體(圖3-8)?；ǚ哿Ｍ耆墒旌螅q氈層也徹底解體消失，同時(shí)藥室內(nèi)壁細(xì)胞徑向迅速伸長(zhǎng)，壁上出現(xiàn)纖維加厚。曼陀羅花藥壁上的藥室內(nèi)壁細(xì)胞為1～2層(圖3-12)?；ǚ勰议_裂時(shí)，花藥壁僅留下表皮和纖維化的藥室內(nèi)壁，中層與絨氈層解體。

2.5 曼陀羅花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾大小之間相關(guān)性

曼陀羅花蕾長(zhǎng)度與花粉發(fā)育之間具有相關(guān)性。造孢時(shí)期，母細(xì)胞時(shí)期和減數(shù)分裂都在小于1.5 cm時(shí)進(jìn)行；四分體時(shí)期和單核中央期在1.5～2.0 cm時(shí)進(jìn)行；單核靠邊和雙核初期在2.0～2.5 cm時(shí)進(jìn)行；雙核初期和雙核后期在2.5～4.0 cm時(shí)進(jìn)行；花蕾長(zhǎng)度在4.0 cm以上時(shí)，花粉都已成熟。小孢子單核靠邊期主要在花蕾長(zhǎng)度2.0 cm左右時(shí)進(jìn)行(表1)。

表1 曼陀羅花粉發(fā)育與花蕾大小相關(guān)性

2.6 曼陀羅花粉活力測(cè)定及花粉粒大小

選取4個(gè)不同發(fā)育階段的花蕾，測(cè)定其花粉活力(表2)。A發(fā)育階段，花粉活力最低，為53.47%。B、C、D發(fā)育階段之間花粉活力沒有顯著差異，分別為81.17%，87.11%和86.70%。對(duì)20個(gè)曼陀羅成熟的花粉粒進(jìn)行大小測(cè)定，其大小(直徑)為(31.58±0.82) μm。

表2 不同發(fā)育階段曼陀羅花粉活力

2.7 曼陀羅果實(shí)特性調(diào)查

成熟的曼陀羅植株，平均株高92.2 cm。每棵曼陀羅產(chǎn)生的果實(shí)數(shù)量較多，平均結(jié)果數(shù)約100。平均單果重4.70 g。果實(shí)心皮數(shù)大部分為4個(gè)，均等(圖4)，極個(gè)別有6個(gè)心皮(圖5)。果實(shí)平均長(zhǎng)度3.5 cm，平均寬度2.5 cm，果皮表面有很多針刺(圖4～6)。每果種子數(shù)約500粒。種子為黑色，圓腎形(圖7)，種子平均長(zhǎng)度3.423 mm，種子平均寬度2.818 mm，種子千粒重7.2 g。

3 討論與結(jié)論

曼陀羅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及雄配子體形成過程與其他茄科植物[14-17]基本相似，屬胞質(zhì)同時(shí)型，四分體屬四面體型，極個(gè)別為十字交叉型，成熟的花粉粒為2-細(xì)胞型。

植物的花粉發(fā)育分為小孢子發(fā)生時(shí)期、雄配體形成期和花粉成熟期3個(gè)階段[18]。植物進(jìn)行花藥培養(yǎng)時(shí)，取材非常關(guān)鍵，取材過早小孢子還未形成，過晚小孢子已經(jīng)形成多核花粉，失去脫分化的能力。所以確定小孢子發(fā)育時(shí)期相對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度大小指標(biāo)很重要。該試驗(yàn)結(jié)果表明，曼陀羅花蕾大小與花粉發(fā)育各個(gè)時(shí)期之間存在相關(guān)性?；ɡ匍L(zhǎng)度大約在2.0 cm時(shí)，小孢子處于單核靠邊期，這個(gè)時(shí)期是大多數(shù)植物進(jìn)行花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期[19-21]。所以，今后進(jìn)行曼陀羅花藥離體培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)取2.0 cm左右長(zhǎng)度的花蕾為宜。

花粉活力一方面受遺傳因素的影響，花粉活力還受環(huán)境因素的影響。影響花粉生活力的主要環(huán)境因素有溫度、濕度和空氣。因此，了解花粉在自然條件下的活力(遺傳因素)、花粉貯藏的條件(環(huán)境因素)，在農(nóng)、林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐和遺傳育種工作中具有重要意義[22-23]。該試驗(yàn)主要研究了曼陀羅植物在自然條件下不同開花階段花粉的生活力，對(duì)曼陀羅植物來說，花粉活力已經(jīng)在開花之前具備，之后的即將開放發(fā)育階段，花朵開放發(fā)育階段到花朵萎蔫期一直都具有較高的活力，這種長(zhǎng)時(shí)間保持花粉活力的優(yōu)勢(shì)為曼陀羅雜交育種提供技術(shù)保證。至于曼陀羅花粉需要什么樣的貯藏條件，有待于進(jìn)一步研究。

植物生殖成功的前提除了與花粉活力有關(guān)外，還受到柱頭可授性的影響。如柱頭的可授期及最佳授粉時(shí)期在植物生殖過程中十分重要，在很大程度上影響著傳粉率及受精率。有關(guān)曼陀羅植物柱頭可授性強(qiáng)弱及最佳授粉時(shí)期，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。