江水清, 李婷, 張一楠, 黃曉紅

(福建師范大學生命科學學院， 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室， 福州 350117)

魚類含豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，在人類食譜中占重要地位。世界上80%的魚產(chǎn)品被人類消耗[1]。我國人口眾多、對魚產(chǎn)品需求量大，但魚類野生資源已趨于枯竭，食用魚主要靠養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的擴大，魚病暴發(fā)愈加頻繁，導致化學藥物大量使用，造成了水質(zhì)惡化、水產(chǎn)品藥物殘余超標和病菌耐藥等惡果，給魚類養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，嚴重制約了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

研究表明，魚類能對病原的攻擊產(chǎn)生免疫反應，包括固有免疫反應(innate immunity)和獲得性免疫反應(adaptive immunity)。感染了鰻弧菌(Vibrioanguillarum)MVAV6203株(鰻弧菌MVM425的aroC基因缺失株，自然條件下不表達毒力因子-鰻弧菌素)的河豚(Takifugurubripes)、斑馬魚(Daniorerio)、大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)體內(nèi)的免疫相關(guān)因子包括IL-1β、TNF-α、MHC I與MHC II、CD8與CD4和IgM等都出現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)，這些細胞反應與用MVM425攻毒后的保護性免疫應答相關(guān)。攻毒結(jié)果顯示，上述各種魚的相對免疫保護率(relative percentage survival，RPS)都較高，分別為90.67%(河豚幼魚)、80.31%(河豚成魚)、80%(斑馬魚)和83%(大菱鲆)[2-5]。此外，MVAV6203使牙鲆(Paralichthysolivaceus)和斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)產(chǎn)生了100%的免疫保護率[6]。病原體的感染可刺激魚體產(chǎn)生固有免疫應答和獲得性免疫應答，使得魚體在遭受病原體的再次感染時能產(chǎn)生更迅速和更強大的免疫反應，從而抵御病原體侵染，保護魚體免受和少受傷害。目前，弱毒疫苗-鰻弧菌MVAV6203株已于2019年4月4日獲得國內(nèi)I類新獸藥證書(〔2019〕新獸藥證字15號)，獲得生產(chǎn)上市許可(http://www.moa.gov.cn/)。因此對魚病進行免疫預防具有理論基礎(chǔ)和成功的實踐。免疫預防既能增強魚類抗病能力，又對環(huán)境無污染，且能保障水產(chǎn)食品安全，因而越來越受到人們的重視。

常用疫苗有傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗等，傳統(tǒng)疫苗又包括滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗是指經(jīng)理化方法處理失去了感染或復制能力，但仍保留抗原性的病原微生物。此類疫苗的安全性較高，但誘發(fā)細胞免疫效果較差，通常在預防病毒和胞內(nèi)細菌感染方面效率較低，需要佐劑或多次加強免疫來誘導保護性免疫[7-9]。而弱毒疫苗是指通過理化方法或在異常條件連續(xù)培養(yǎng)傳代的方法使病原致病性降低為弱毒力或自然低毒力，但仍有繁殖能力和免疫原性的病原微生物。其雖能有效地誘導細胞免疫，但可能存在毒力恢復、或因殘余毒力太強而引起接種損失或污染環(huán)境等安全性問題，因此某些國家(比如日本)禁止水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用弱毒疫苗[10-13]。此外，傳統(tǒng)疫苗需要大量的病原微生物來制備。有的病原微生物難以或不能培養(yǎng)，導致缺乏穩(wěn)定的抗原材料來源；有的病原微生物成分復雜，不易標準化生產(chǎn)和使用。因此開發(fā)魚用基因工程疫苗迫在眉睫，以彌補傳統(tǒng)疫苗之不足。

基因工程疫苗是利用重組DNA技術(shù)對抗原基因進行克隆和表達或修飾，并利用重組體本身或表達產(chǎn)物制備的疫苗，包括基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗、活載體疫苗以及突變疫苗或基因缺失疫苗4大類。因其操作簡便，對漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境無污染，有著廣泛的應用前景。早在1988年，Gilmore等[14]研究表明，用重組表達的IHNV糖蛋白免疫虹鱒魚，魚體能產(chǎn)生一定的免疫保護作用，從此開啟了魚用基因工程疫苗研究的大門。

1 亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗(subunit vaccine)是指將病原體抗原表位與載體連接構(gòu)建重組表達載體，利用原核或真核表達系統(tǒng)表達基因產(chǎn)物(重組多肽或重組蛋白)制備的疫苗。異源表達的重組亞單位疫苗既可以解決抗原供應和疫苗的安全性問題，又可以隨時根據(jù)試驗需要獲得，還可以實現(xiàn)標準化生產(chǎn)和使用。魚用亞單位疫苗研究中常用的表達系統(tǒng)主要包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)。

1.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)

大腸桿菌(Escherichiacoli)已被全基因組測序，遺傳背景清晰，且被美國食品及藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準為安全的基因工程受體生物。E.coli表達系統(tǒng)具有操作簡便、成本低、產(chǎn)量高和技術(shù)成熟等優(yōu)勢，成為重組亞單位疫苗最常用的表達系統(tǒng)。

草魚呼腸孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)能對草魚(Ctenopharyngodonidellus)造成致命的出血性疾病，對草魚養(yǎng)殖業(yè)造成災難性的破壞。Pei等[15]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得GCRV重組外殼蛋白rVP56，并從腹腔注射免疫魚體。結(jié)果表明，rVP56的免疫使草魚體內(nèi)白細胞數(shù)量和抗體滴度均顯著提高， GCRV攻毒后魚的存活率顯著高于對照組。推測VP56蛋白可能與GCRV病毒的入侵有關(guān)，有望作為草魚抗GCRV感染的亞單位疫苗的靶點。

近年來，細菌性病原體也吸引了不少學者對其進行研究。Valderrama等[16]用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備的美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)的外膜蛋白rFrpA免疫塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)，獲得79.3%的免疫保護率。另外，以大腸桿菌重組表達的無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的8種結(jié)構(gòu)蛋白(rAP、rAL、rLivk、rESAT6、ressA、ressB、ressC和resaA)均能誘發(fā)羅非魚(Oreochromisniloticus)產(chǎn)生保護性免疫反應，魚體內(nèi)TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MHC-IIa、MHC-IIb和CD8α含量顯著上調(diào)[17]。

目前，相對病毒和細菌性病原體，寄生蟲重組亞單位疫苗的研究相對較少。He等[18]利用大腸桿菌重組表達多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifilis)抑動抗原，致死劑量攻毒結(jié)果顯示，受免魚體的存活率達95%，而對照組的存活率僅為55%。另外，人們通過大腸桿菌重組表達了鯉吉陶單極蟲(Thelohanelluskitauei)[19]和刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)[20]等寄生蟲的抗原基因，但該重組蛋白能否激發(fā)魚體產(chǎn)生有效的免疫保護作用尚未見報道。

原核表達系統(tǒng)的不足之處在于缺乏真核細胞所具有的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾作用，如無法對重組蛋白進行糖基化修飾等，從而可能會影響重組蛋白的免疫活性。此外原核表達系統(tǒng)的表達產(chǎn)物容易在胞內(nèi)形成包涵體，不易純化。

1.2 真核表達系統(tǒng)

1.2.1酵母表達系統(tǒng) 酵母是真核單細胞生物，繁殖迅速，生長周期短，可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；能對分泌蛋白進行修飾，使肽鏈正確折疊成天然蛋白，重組蛋白更具生物活性；安全無毒，被公認為益生菌并作為一種食品添加劑，因此，適宜作為疫苗載體。酵母表達系統(tǒng)已成為僅次于大腸桿菌表達系統(tǒng)的第二大蛋白表達系統(tǒng)。在眾多品質(zhì)優(yōu)良的酵母菌株中，被用于魚用基因工程疫苗研究的主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)[21]和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[22]3種類型。其中釀酒酵母在魚用基因工程亞單位疫苗的研究中使用頻率最高，詳見表1。

表1 釀酒酵母表達系統(tǒng)在魚類病原體重組蛋白制備中的應用Table 1 Expressions of the recombinant proteins of fish pathogens using Saccharomyces cerevisiae

釀酒酵母是第一個完成全基因組測序的真核生物，被歐洲藥品管理局(European Medicine Evaluation Agency, EMEA)和FDA批準用于生產(chǎn)重組療法所需的真核細胞微生物蛋白[30]。用表達CyHV-3的ORF131基因片段的重組酵母經(jīng)口免疫鯉魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受免魚體內(nèi)的IFN-γ、 IFN-1β、 IFN-a1、 CXCa 、CXCL8-L1和抗體IgM的表達量上升，說明該重組酵母表達的rORF131不僅引起了促炎癥因子的反應，也誘發(fā)了特異性抗體的生成，使得鯉魚抗CyHV-3感染的能力顯著提高，相對保護率達到53.33%[23]。同時，以CyHV-3的ORF65抗原基因制備的重組疫苗也具有免疫保護效應[31]。

但用酵母表達重組蛋白也存在一些不足之處，如發(fā)酵時間較長，可能含有不正確的蛋白糖基化，培養(yǎng)上清中多糖濃度較高，不利于純化。這些局限性對酵母表達系統(tǒng)的發(fā)展有一定影響，因此，酵母表達系統(tǒng)仍然需要進行優(yōu)化。

1.2.2昆蟲細胞表達系統(tǒng) 昆蟲細胞表達系統(tǒng)的載體為桿狀病毒(Baculovirus)，受體細胞是昆蟲細胞，如使用廣泛的草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞系。含有外源基因的重組桿狀病毒能在昆蟲細胞內(nèi)進行基因組的自我擴增，并實現(xiàn)外源基因的表達。

Lecocq-Xhonneux 等[32]于1994年將昆蟲細胞表達系統(tǒng)用于魚用亞單位疫苗的研究。他們用Sf9細胞表達的重組VHSV G蛋白注射免疫虹鱒魚，增強了虹鱒魚抗VHSV感染的能力，相對保護率達80.2%。而Standish等[33]用含VHSV亞型VHSV-IVbG基因的桿狀病毒感染粉紋夜蛾(Cabbagelooper)幼蟲，用純化后的重組G蛋白免疫北美狗魚(Esoxmasquinongy)，受免魚抗VHSV能力提高，RPS達80%。

昆蟲細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：桿狀病毒的宿主專一性強，安全性高；具有重組蛋白翻譯后加工的機制，使得重組蛋白的活性及抗原性等更接近天然蛋白；載體可容納大分子插入片段等。因此，昆蟲細胞表達系統(tǒng)常用于重組亞單位疫苗的研究。但昆蟲細胞重組表達的外源蛋白糖基化方式和哺乳動物相比仍然存在一定差異。

1.2.3四膜蟲表達系統(tǒng) 嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)是一種真核單細胞模式生物，遺傳背景清晰，且功能的保守性高于酵母。四膜蟲可無菌純培養(yǎng)，易于在廉價的培養(yǎng)條件下快速生長(每代2～2.5 h)繁殖到高密度。因此在具備四膜蟲基因操作技術(shù)和蟲種保藏技術(shù)后，研究人員開發(fā)了四膜蟲表達系統(tǒng)，并認為該系統(tǒng)適宜用于工業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白。更重要的是，一些魚類寄生纖毛蟲(如刺激隱核蟲和多子小瓜蟲)與四膜蟲一樣，用UAA和UAG(通用的終止密碼子)編碼谷氨酰胺，因此，它們的基因無法在常規(guī)的表達系統(tǒng)中表達，但四膜蟲表達系統(tǒng)可直接表達以上兩種病原的基因，獲得更接近于天然結(jié)構(gòu)的重組蛋白。

Mo等[34]利用T.thermophila重組表達的C.irritans的抑動抗原rGDCI3 I-antigen免疫橙點石斑魚(Epinephelusbleekeri)后發(fā)現(xiàn)，這些魚的血清抗體IgM高于磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組，且rGDCI3 I-antigen免疫組的累積保護率為25%，顯著高于對照組。另外，以T.thermophila重組表達的I.multifilis抑動抗原Iag的免疫原性良好，能使歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)產(chǎn)生有效的免疫保護作用[35]。

目前四膜蟲表達系統(tǒng)常用的啟動子為T.thermophila金屬硫蛋白編碼基因(MTT1)的啟動子，需要Cd2+作為誘導劑[34-37]，而Cd2+為重金屬離子，對動物和人的毒性較大，且會污染環(huán)境。因此，利用該表達系統(tǒng)表達外源蛋白，會引發(fā)環(huán)境污染和水產(chǎn)品食品安全問題，嚴重制約了四膜蟲表達系統(tǒng)的發(fā)展和應用。于是Yu等[38]以T.thermophila細胞質(zhì)熱休克蛋白編碼基因Hsp70-2作為啟動子，經(jīng)熱休克誘導而實現(xiàn)了綠色熒光蛋白GFP在四膜蟲中重組表達。與MTT1啟動子相比，Hsp70-2啟動子的轉(zhuǎn)錄效率顯著增強。同時，以Hsp70-2作為啟動子，且基于T.thermophila小核rDNA改造得到pD5H8載體，熱誘導后得到大量具有生物活性的重組抗原[39-40]。而üstüntanr Dede等[41]以Hsp70-2基因、rDNA復制起始點和端粒序列構(gòu)建了第一個大核人工染色體，并在四膜蟲體內(nèi)實現(xiàn)GFP的重組表達。另外，以嘌呤霉素抗性基因作為重組表達載體的篩選標記能提高重組T.thermophila的篩選效率[42]。

以上結(jié)果表明，以Hsp70-2基因作為啟動子解決了重金屬離子Cd2+帶來的污染問題，且實現(xiàn)外源基因在T.thermophila中的高效表達，這對四膜蟲表達系統(tǒng)應用于魚用基因工程疫苗研究具有重要意義。然而，Hsp70-2存在轉(zhuǎn)錄活性受熱休克抑制的缺陷[38]，因此還需進一步研究并優(yōu)化。由此可見，尋找更安全和高效的啟動子和誘導劑完善四膜蟲表達系統(tǒng)是今后的重要任務(wù)。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng) 目前，在魚類基因工程疫苗研究領(lǐng)域，利用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導或微粒轟擊等方法使外源基因和植物核基因組整合，實現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的重組表達。Shin等[43]以重組表達虹彩病毒(Iridovirus)衣殼蛋白(MCP)的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織喂食條石鯛，攻毒結(jié)果顯示，對照組全部死亡，而免疫組的存活率為80～90%。表明該重組愈傷組織能對條石鯛起到有效地抵抗虹彩病毒攻擊的免疫保護作用，說明該MCP可能在虹彩病毒侵染宿主過程中起重要作用，可作為疫苗的候選基因。

近年來利用藻類來表達外源蛋白的技術(shù)逐漸受到人們的關(guān)注。用藻類表達外源蛋白，培養(yǎng)周期較轉(zhuǎn)基因植物短，可以完成復雜的蛋白折疊，形成有活性的重組外源蛋白；且有的藻類能被動物直接食用，從而降低純化成本。Shahin等[44]首次用硅藻(Diatom)重組表達了東方弗朗西斯菌(Francisellaorientalis，F(xiàn)o)的一種熱休克蛋白(GroEL)和外膜蛋白(IglC)，免疫羅非魚后結(jié)果表明，rGroEL或rIglC免疫增強了尼羅羅非魚抵御Fo的能力，受免魚的RPS達53～75%。除硅藻外，有報道顯示萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)也可作為外源基因重組表達載體[45]。

植物細胞的細胞壁可保護目標抗原蛋白免受動物胃部消化或者降解，除此之外，植物表達系統(tǒng)還具有成本低、適合大規(guī)模生產(chǎn)、安全無毒等特點，而且能對抗原進行翻譯后的修飾，從而保證其抗原性。但轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)操作費時，目標蛋白表達量較難提高，且分離純化難度較大。

1.3 病毒樣顆粒亞單位疫苗

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，病毒樣顆粒(Virus-likeparticles，VLPS)疫苗得到發(fā)展。作為一種新型的基因工程疫苗，VLPS疫苗是亞單位疫苗的一種，但和重組亞單位疫苗又有所不同，它的特點是：①不具傳染性，安全可靠；②有很好的免疫效應；③不含核酸，不能自主復制；④疫苗大小合適，是很有前景的基因工程疫苗[46-47]。以本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和煙草BY-2細胞表達并組裝的神經(jīng)壞死病毒樣顆粒(NervousNecrosisVirus-likeParticles，NNV VLPs)在冷凍電鏡下呈直徑20～30 nm大小的二十面體球狀三維結(jié)構(gòu)，對歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)有一定的免疫保護效果，RPS為63.6～86.5%[48]。

亞單位疫苗因不含病原的毒力因子，安全性高，成分簡單明了、穩(wěn)定性較好，有利于標準化生產(chǎn)和使用，成為理想的基因工程疫苗。其關(guān)鍵在于篩選到高效的靶標基因及選擇合適的表達系統(tǒng)。目前真核表達的重組蛋白抗原性相對較好，但有些代價較高(如昆蟲細胞表達系統(tǒng))，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。原核表達系統(tǒng)操作簡便、技術(shù)成熟、成本低，但有些重組蛋白的免疫原性較差。因此一些研究者對佐劑進行深入研究，如Tang等[49]以牙鲆的白介素2(Interleukin-2 ，IL-2)作為佐劑與重組表達的愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)外膜蛋白V(OutermembraneproteinV，OmpV)混合后免疫牙鲆，攻毒后的結(jié)果顯示，混合蛋白免疫組的RPS達71%，而rOmpV免疫組僅為40%，說明牙鲆的IL-2分子有作為提高基因工程亞單位疫苗免疫效果的佐劑潛能。

自1988年第一次發(fā)現(xiàn)重組蛋白能增強虹鱒魚的免疫保護作用以來[14]，人們對基因工程疫苗在魚病的免疫防治方面的研究已有32個年頭。但直至目前，商品化亞單位疫苗仍然數(shù)量不多，僅以IPNV的G蛋白VP2和 VP3片段制備的亞單位口服疫苗在美國和加拿大獲準上市；以VP2制備的亞單位注射接種疫苗在加拿大、挪威和智利獲準上市[50]；以SVCV G蛋白制備的亞單位注射接種疫苗在比利時獲準上市[50]。由此表明，魚用基因工程亞單位疫苗仍有很大的發(fā)展空間，需要進一步的深入研究和實踐。

2 DNA疫苗

DNA疫苗通過將攜帶有編碼所選抗原蛋白的特定基因的重組真核表達質(zhì)粒注入宿主體內(nèi)，使其在宿主體內(nèi)表達抗原蛋白，從而刺激誘發(fā)宿主產(chǎn)生免疫應答。1996年，Anderson等[51]制備了含IHNVG基因的DNA疫苗pCMV4-G，通過肌肉注射免疫虹鱒魚，增強了虹鱒魚抵御該病毒感染的能力，從而開啟了魚用核酸疫苗的應用研究。IPNV和IHNV 均易引發(fā)鮭魚的高致死率。研究發(fā)現(xiàn)，IPNV的VP2基因具有很好的免疫原性[52]。Ahmadivan等[53]用重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-VP2免疫虹鱒魚，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-VP2免疫魚血清抗體能識別IPNV，該抗體能持續(xù)長達90 d。在攻毒后免疫魚的RPS為76.45～88.23%。病毒性出血性敗血癥病毒(Viralhemorhagicsepticemiavirus，VHSV)是單鏈 RNA 病毒，結(jié)構(gòu)簡單，是目前研究較多的病原體之一。Standish等[54]發(fā)現(xiàn),VHSV亞型VHSV-IVb 的DNA疫苗pVHSivb-G對北美狗魚、虹鱒、褐鱒(Salmotrutta)和湖鱒(Salvelinusnamaycush)等四種魚抵御該病毒感染的能力顯著提高。

對細菌和寄生蟲性魚病的DNA疫苗研究也有報道。鰻弧菌是三大致病弧菌之一，宿主廣泛，危害嚴重。Xing等[55]以鰻弧菌VAA基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VAA并用于肌肉注射免疫牙鲆，結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫魚肌肉組織中檢測到VAA蛋白的表達，且魚體內(nèi)sIgM+、CD4-1+、CD4-2+和CD8β+等淋巴細胞數(shù)量顯著增加；攻毒后免疫魚的RPS為50%。即pcDNA3.1-VAA可能是一種良好的疫苗候選物，能增強牙鲆對鰻弧菌感染的抵御。Xu等[56]用多子小瓜蟲抑動抗原構(gòu)建了DNA疫苗，發(fā)現(xiàn)能顯著提高斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的特異性抗體水平，當劑量為10 μg·條-1時，受免魚體的RPS為20%；當用劑量為20 μg·條-1時，或10 μg·條-1的劑量接種2次，能使受免魚的RPS分別達到35.6%和48.9%[57]。Josepriya 等[58]用刺激隱核蟲抑動抗原制備的DNA疫苗免疫斜帶石斑魚，發(fā)現(xiàn)石斑魚抗刺激隱核蟲感染的能力增強。攻毒劑量分別為1 000、1 300和1 500幼蟲數(shù)·g-1時，免疫石斑魚的RPS分別為100%、 96%與15%，說明該DNA疫苗對魚體起到一定的免疫保護作用，但免疫保護程度隨攻毒強度存在差異。

與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗僅編碼單一的病原體基因，DNA分子穩(wěn)定、安全，基本不存在毒性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。但DNA疫苗還不夠成熟，目前，無法確定宿主基因組是否會與外源DNA整合，從而打破宿主體內(nèi)癌基因和抑癌基因的平衡。另外，Dalmo等[59]認為,DNA疫苗存在潛在的副作用，包括機體對表達抗原的免疫耐受性、染色體整合和注射部位炎癥等。近年來，除了DNA疫苗，另一類魚用核酸疫苗——RNA疫苗也引起人們的關(guān)注。RNA疫苗具有許多優(yōu)點，如RNA不具感染力，可通過正常細胞過程降解，不存在感染或插入誘變的潛在風險。針對魚用RNA疫苗的研究，Wolf等[60]發(fā)現(xiàn)，將載體—鮭魚甲病毒(Salmonidalphavirus)與傳染性鮭貧血病毒(Infectioussalmonanemiavirus，ISAV)血凝素脂酶基因連接而制備的RNA復制子疫苗能刺激大西洋鮭魚(Salmosalar)產(chǎn)生抗體和炎癥因子，有效抵抗ISAV的感染，大西洋鮭魚的RPS為69.2%。由此表明,RNA疫苗在魚用疫苗有著光明的應用前景。

目前，國外已有數(shù)種DNA疫苗獲準上市，2003年，針對IHNV制備的DNA 疫苗在英國哥倫比亞通過審批，是全球首個獲執(zhí)照許可的DNA 疫苗[61]，且2005年在加拿大獲準上市[62]；2018年，防御鮭胰腺病病毒(Salmonpancreaticdiseasevirus，SPDV)的DNA 疫苗在挪威和歐盟獲準上市[54]。

3 活載體疫苗

活載體疫苗(live vector vaccine)指將病原體的抗原基因和非致病性病原體基因進行整合后構(gòu)成的重組活載體疫苗。活載體疫苗具有以下優(yōu)點：①效力高、成本低、對環(huán)境安全無毒；②可制備多價疫苗或多聯(lián)疫苗，從而起到一針防多病的效果。目前，活載體疫苗在魚用疫苗上的研究主要包括細菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗。

3.1 細菌活載體疫苗

細菌活載體疫苗在魚用活載體疫苗研究中較多。目前，用于魚用細菌活載體研究的有：愛德華氏菌[63]、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[64]、大腸桿菌[65]和一些益生菌微生物等。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)均為益生菌，安全無毒，能促進腸道更好地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，增強機體免疫力，兩者均可作為載體表達外源蛋白。以攜帶維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)flaB基因或OmpAI基因的重組干酪乳桿菌免疫錦鯉(Cyprinuscarpio)，維氏氣單胞菌攻毒后，對照組魚體全部死亡，免疫組的RPS大于50%[66-67]。另外，有研究表明，用乳酸乳球菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)構(gòu)建的重組活載體疫苗也能引發(fā)宿主產(chǎn)生保護性免疫反應[68-73]。

3.2 病毒載體疫苗

現(xiàn)階段對病毒活載體疫苗的研究較少。病毒活載體疫苗的載體一般為減毒株，將外源抗原插入到載體基因組的非必要區(qū)形成重組的新病毒，外源基因隨載體的復制而表達。目前，用于魚用病毒活載體研究的有桿狀病毒(Baculovirus)、腺病毒(Adenovirus)和IHNV等。Li等[74]利用腺病毒包裝技術(shù)得到大量高滴度的IHNVG基因過表達的腺病毒活載體疫苗，免疫虹鱒魚后結(jié)果顯示，疫苗免疫組魚體的致死率為8%，遠遠低于對照組100%死亡率，且其免疫相關(guān)基因和抗體滴度水平顯著升高，RPS達92%，說明該腺病毒活載體疫苗能使虹鱒魚抵御IHNV感染的能力增強，有作為候選疫苗的潛力。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒和IHNV均能作為疫苗載體，引發(fā)宿主有效的免疫保護作用[75-76]。

4 基因缺失疫苗或突變疫苗

基因缺失疫苗或突變疫苗是指病原體的某致病基因中的一段序列發(fā)生突變或缺失形成的減毒株疫苗。這類疫苗使用有活性的減毒微生物，能在宿主體內(nèi)長時間發(fā)揮作用并誘導強烈免疫反應，整個過程無需添加佐劑且成本較低。

Vaughan等[77]最早進行魚用基因突變疫苗研究，結(jié)果表明,減毒型殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida) 能作為良好的抗原激活魚類免疫系統(tǒng)，引發(fā)特異性免疫反應。減毒的愛德華氏菌是目前在基因突變疫苗研究中應用較多的抗原之一，以野生型愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，T3SS)的四個結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失株EpDssaV、EpDesaM、EpDyscR和EpDescT免疫鯰魚(Silurusasotus)后發(fā)現(xiàn)，基因缺失株的毒力降低，對鯰魚的致死率為0～16%，顯著低于野生株的致死率(26%)，免疫后鯰魚產(chǎn)生了100%的免疫保護率[78]。另外，使愛德華氏菌T3SS的其他基因發(fā)生突變也能降低愛德華氏菌的毒性，刺激宿主產(chǎn)生有效的免疫保護作用[79-80]。

目前，國外還沒有獲準商品化的基因突變疫苗。而國內(nèi)，aroC基因欠缺的鰻弧菌弱毒活疫苗(MVAV6023株)已獲得生產(chǎn)上市許可，這也是目前國內(nèi)唯一獲得生產(chǎn)許可的魚用基因工程疫苗[3, 6, 81]。雖然基因突變疫苗免疫原性較高，能較好地刺激魚體產(chǎn)生保護性免疫效應，但基因突變疫苗也存在一些缺點，如疫苗含有一定殘余的毒力，可能引起宿主死亡；且疫苗可能會由于“毒力返祖”現(xiàn)象引發(fā)交叉感染。

5 存在問題及展望

魚用基因工程疫苗確實能對宿主起到有效的免疫保護作用，但用于實際生產(chǎn)和應用的疫苗種類并不多。目前，為數(shù)不多的商品化魚用基因工程疫苗主要是亞單位疫苗和DNA 疫苗，活載體疫苗還未見有商業(yè)化產(chǎn)品?；蛲蛔円呙珉m然免疫原性良好，但存在疫苗穩(wěn)定性和安全性問題；活載體疫苗免疫效果良好，成本低，可誘導宿主產(chǎn)生較廣泛的免疫反應，包括黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫等，但由于缺乏穩(wěn)定和持續(xù)高表達的異源基因表達系統(tǒng)，因此制約了活載體疫苗的發(fā)展。

亞單位疫苗免疫后宿主體內(nèi)抗體出現(xiàn)時間早、副作用少，但蛋白純化工藝成本較高，重組后表達的抗原免疫原性較弱、持續(xù)性較差。與亞單位疫苗相比，DNA 疫苗制備簡便，能在宿主體內(nèi)長時間持續(xù)引發(fā)強烈的免疫反應，免疫效果顯著。Sun等[82-83]對亞單位疫苗和DNA疫苗在魚體誘發(fā)的免疫應答進行比較發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗能夠同時誘發(fā)魚體的細胞和體液免疫應答，而亞單位疫苗主要誘發(fā)魚體的體液免疫應答。Embregts等[84]制備了SVCV的DNA疫苗pcDNA3-SVCV-G，同時利用昆蟲細胞Sf21制備亞單位疫苗bAc-SVCV-G，分別用兩種疫苗免疫歐洲鯉魚(Cyrpinuscarpiocarpio)后，DNA疫苗免疫組魚體能獲得90%的存活率，而亞單位疫苗免疫組的存活率僅為5～30%。另外，Pumchan等[85]制備了編碼無乳鏈球菌多個肽段的DNA疫苗(pcDNA3.1-42E2和pcDNA3.1-45F2)和經(jīng)大腸桿菌重組表達的亞單位疫苗(r42E2和r45F2)分別免疫尼羅羅非魚后發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗免疫組的RPS顯著高于亞單位疫苗免疫組。但Xing等[55, 86]制備了鰻弧菌VAA基因的DNA疫苗pcDNA3.1-VAA和經(jīng)大腸桿菌表達的亞單位疫苗rVAA免疫牙鲆后發(fā)現(xiàn)，亞單位疫苗免疫組牙鲆的RPS顯著高于DNA疫苗免疫組。由此推斷可能和接種疫苗的劑量、抗原基因本身的免疫原性、接種方式和次數(shù)、以及佐劑的使用和環(huán)境條件等因素的影響有關(guān)。通過Collins[87]和Dalmo[59]對魚用DNA疫苗的研究表明，目前針對抗原成分相對簡單的病毒性病原體的魚用DNA 疫苗研究較多，抗原片段多數(shù)為編碼病毒外殼蛋白的結(jié)構(gòu)成分。

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)日益發(fā)展和人們對健康魚產(chǎn)品的需求，推動著我國魚用疫苗的研究和發(fā)展。到目前為止，針對GCRV、愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)和鰻弧菌等病原體，國內(nèi)已有7款魚用疫苗獲得批文并正式上市[81]。但僅有鰻弧菌弱毒活疫苗為魚用基因工程疫苗，其他6款魚用疫苗均是以注射方式接種的非基因工程疫苗?；蚬こ桃呙绲臄?shù)量少且種類單一，可能是由于基因工程疫苗還存在以下問題。①基因工程疫苗本身亦存在安全性問題，如：整合到宿主染色體的DNA疫苗有可能激活癌基因的表達；大規(guī)模疫苗生產(chǎn)過程中的安全性控制問題等。由此可見，生物安全問題是影響我國魚用基因工程疫苗發(fā)展的一個重要因素。②現(xiàn)階段，人們對魚體免疫系統(tǒng)的作用機制和一些病原體的致病機理了解還不夠清晰。③國外的魚用疫苗在研發(fā)、生產(chǎn)和應用過程已形成了一套完整的產(chǎn)業(yè)鏈，技術(shù)較為成熟[88]，而我國魚用疫苗研究大多處于基礎(chǔ)研究水平，實用型疫苗研發(fā)能力有待進一步提高，研發(fā)與生產(chǎn)存在脫節(jié)現(xiàn)象。

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)日益發(fā)展，越發(fā)多樣復雜的病害給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。物理化學方法的防治會使魚體內(nèi)殘余化學藥物超標，影響人體健康；藥物的長期使用或濫用會破壞生態(tài)平衡。正所謂挑戰(zhàn)與機遇并存，現(xiàn)代生物科學技術(shù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，為我國魚用基因工程疫苗的研制、開發(fā)以及商業(yè)化發(fā)展創(chuàng)造了機會。因此，在基因工程疫苗研發(fā)模式上，我國應逐漸與國外接軌，加強企業(yè)與研究所或高校的合作；增加研發(fā)資金的投入，利用轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等多種組學和現(xiàn)代分子生物學技術(shù)對魚體抗病原體感染關(guān)鍵基因與病原體致病因子開展生物學功能與作用機制的研究，采用多學科相結(jié)合的方法綜合分析病原體的遺傳機制，增強我國魚用基因工程的研發(fā)能力。如Ngo等[89]對英國的315種嗜冷黃桿菌(Flavobacteriumpsychrophilum)的遺傳多樣性進行分析，為疫苗的開發(fā)提供了重要的流行病學數(shù)據(jù)。促進魚用基因工程疫苗的產(chǎn)業(yè)升級，使其發(fā)展軌道規(guī)范化、標準化和法制化，努力健全魚用基因工程疫苗的安全評價體系，簡化產(chǎn)品的注冊審批流程，加快疫苗從實驗室走向商品化的步伐。

基因工程疫苗是疫苗發(fā)展史上一次新的革命，是一種有前景的防治方法。通過基因工程手段篩選出強免疫原性的抗原并研制出有效疫苗被視為防治病原體感染的有效途徑之一，從而減少對養(yǎng)殖生態(tài)的破壞，使水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展、食品安全得到保障，對進一步創(chuàng)造和發(fā)展良好的經(jīng)濟與社會效益具有重要意義。隨著生命科學技術(shù)高速發(fā)展及其在疫苗研制上的應用，及對魚免疫系統(tǒng)和病原體感染機制的了解和加深，高效、穩(wěn)定和安全的魚用基因工程疫苗將被深入研究與廣泛應用，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展提供安全保障。