后博， 梁爽， 嵇曉艷

胃癌是我國(guó)常見的一種惡性腫瘤疾病，其發(fā)病率高，在我國(guó)惡性腫瘤疾病譜中居首位[1]。胃癌的發(fā)病位置較多，包含胃竇、胃體及胃底等部位，且其發(fā)病初期的臨床癥狀并不明顯，確診時(shí)疾病已經(jīng)進(jìn)展，導(dǎo)致患者錯(cuò)失了最佳的治療時(shí)機(jī)，大大影響了患者的預(yù)后，因此在胃癌的初期如何有效地進(jìn)行診斷，已成為臨床研究的熱門話題。胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在較多的分子異常表達(dá)，研究其異常表達(dá)情況對(duì)了解胃癌的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療方式的選擇具有重要意義，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-Met)信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，通路激活對(duì)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲起促進(jìn)作用[2-3]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1(MACC1)是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因，具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用，MACC1還能與c-Met結(jié)合，激活HGF/c-Met信號(hào)通路。本研究通過研究胃癌組織內(nèi)MACC1的表達(dá)情況，分析MACC1與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系以及與HGF、c-Met的相關(guān)性，以期為胃癌的臨床診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取濱?？h人民醫(yī)院2017年9月至2019年9月收治的88例胃癌患者，其中男53例，女35例；年齡55～75歲，平均(65.27±8.54)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2017-19號(hào))。由腫瘤科責(zé)任護(hù)士向患者及家屬講解本次研究的目的及方法，患者均自愿參與并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照“中國(guó)早期胃癌篩查及內(nèi)鏡診治共識(shí)意見”[4]確診為胃癌；②年齡18～85歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)評(píng)估患者生存時(shí)間<3個(gè)月；②存在免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病；③同時(shí)存在嚴(yán)重的肝腎功能異?；蛐哪X血管疾??；④精神異常無法配合本次研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)胃癌組織內(nèi)MACC1、HGF及c-Met表達(dá)水平 所有患者入院后均在治療前行胃腸鏡檢查，取胃癌組織及癌旁正常組織各4塊，用10%福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后制成厚3～4 μm的切片，切片脫蠟水化后參照SP免疫組化試劑盒染色說明書進(jìn)行操作，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色結(jié)果。其中兔抗人MACC1多克隆抗體、兔抗人HGF多克隆抗體、兔抗人c-Met多克隆抗體均購自美國(guó)Abcam公司，SP免疫組化試劑盒、DBA試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。MACC1陽性主要定位在細(xì)胞質(zhì)，少量在細(xì)胞核；HGF陽性定位在細(xì)胞質(zhì)；c-Met陽性定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)。判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：依據(jù)細(xì)胞染色程度(染色深淺與背景著色對(duì)比)與陽性細(xì)胞占比評(píng)分的乘積判定，染色程度分別給予0分(不著色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)，陽性細(xì)胞占比評(píng)分分別給予0分(≤10%)、1分(11%～50%)、2分(51%～75%)、3分(>75%)，兩項(xiàng)評(píng)分之積>3分為陽性，≤3分為陰性。比較胃癌組織及癌旁正常組織內(nèi)MACC1、HGF、c-Met的陽性檢出率。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MKN28及MKN45中MACC1 mRNA表達(dá)水平 胃癌細(xì)胞株MKN28、MKN45均購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，以Trizol提取細(xì)胞總DNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度后，使用試劑盒將DNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以Primer設(shè)計(jì)MACC1引物：正向5′-CTTTTGATTCCTCCGGTGA-3′，反向5′-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3′，擴(kuò)增片段136 bp。以β-actin為內(nèi)參：正向5′-CACCAACTGG-GACGACAY-3′，反向5′-ATGTCACG-CACGATTTCC-3′，擴(kuò)增片段407 bp，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μl，MACC1正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μl，DNA模板2.0 μl，dH2O 6.4 μl，共20 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。所得結(jié)果以比較Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析[6]。比較胃癌細(xì)胞株MKN28及MKN45中的MACC1 mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織內(nèi)MACC1、HGF、c-Met的陽性檢出率比較

胃癌組織內(nèi)MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1～2。

表1 不同組織內(nèi)MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率比較 [n=88，例(%)]

圖1 胃癌組織內(nèi)MACC1陽性(1A)、HGF陽性(1B)、c-Met陽性(1C)圖像(免疫組化法 ×100)

圖2 癌組織內(nèi)MACC1陰性(2A)、HGF陰性(2B)、c-Met陰性(2C)圖像(免疫組化法 ×100)

2.2 不同臨床病理特征胃癌患者M(jìn)ACC1、HGF、c-Met陽性表達(dá)率比較

不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位患者的MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低分化、浸潤(rùn)深度T3～T4、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者的MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征胃癌患者的MACC1、HGF、c-Met陽性表達(dá)率比較 [例(%)]

2.3 胃癌細(xì)胞株MKN28及MKN45中MACC1 mRNA表達(dá)水平比較

胃癌細(xì)胞株MKN28中MACC1 mRNA表達(dá)水平為(3.58±0.08)，低于MKN45中MACC1 mRNA表達(dá)水平(4.48±0.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=58.540，P<0.001)。

2.4 MACC1與HGF、c-Met的相關(guān)性分析 MACC1與HGF、c-Met均呈正相關(guān)(rs=0.534、0.491，P<0.05)。

3 討論

胃癌是一種源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤。近年來隨著人們生活方式及生活習(xí)慣的改變，該病的發(fā)病率也呈明顯上升趨勢(shì)，因此其診療工作也愈發(fā)受到臨床醫(yī)師及患者的關(guān)注[7-8]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中有多條信號(hào)通路參與，其中HGF/c-Met信號(hào)通路是參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的信號(hào)通路之一，可對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)。而MACC1是近年新發(fā)現(xiàn)的一種基因，能夠激活HGF/c-Met信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究以HGF/c-Met信號(hào)通路為紐帶，探討MACC1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制，以期為胃癌患者的診斷、治療提供新思路。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織內(nèi)MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率顯著高于癌旁正常組織，提示胃癌患者癌組織中MACC1、HGF、c-Met陽性表達(dá)水平高。姚繼彬等[9]研究也發(fā)現(xiàn)胃癌組織內(nèi)MACC1呈高表達(dá)，且陽性檢出率明顯高于癌旁正常組織，與本研究結(jié)果基本相符。MACC1包含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即SH3、ZU5及2個(gè)DD，其中SH3中具有酪氨酸殘基，當(dāng)DNA出現(xiàn)損失時(shí)，酪氨酸殘基會(huì)出現(xiàn)磷酸化，形成級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，促進(jìn)癌細(xì)胞的分裂及轉(zhuǎn)移[10-11]；HGF是一種具有多功能的細(xì)胞活性因子，具有促有絲分裂作用，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞形成細(xì)胞離散及運(yùn)動(dòng)[12]；c-Met則是HGF的受體，在各種上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，當(dāng)c-Met與HGF結(jié)合后能夠促使細(xì)胞增殖、分化[13-14]。同時(shí)MACC1還是HGF/c-Met信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子，與c-Met啟動(dòng)子結(jié)合后會(huì)激活HGF/c-Met信號(hào)通路，MACC1通過對(duì)c-Met的轉(zhuǎn)錄激活，參與HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，形成一個(gè)正反饋循環(huán)，促進(jìn)腫瘤惡變、侵襲和轉(zhuǎn)移，故胃癌患者癌組織內(nèi)MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率高。

本研究結(jié)果顯示TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低分化、浸潤(rùn)深度T3～T4、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者的MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率較高，表明MACC1、HGF、c-Met陽性與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。TNM分期、分化程度及浸潤(rùn)深度是評(píng)估惡性腫瘤進(jìn)展情況的重要依據(jù)，分化程度低、TNM分期高、浸潤(rùn)深度T3～T4往往代表腫瘤惡化、侵襲程度嚴(yán)重，分化程度高、TNM分期低、浸潤(rùn)深度T1～T2則表明腫瘤惡性程度較輕[15-16]。分析原因可能是MACC1激活HGF/c-Met信號(hào)通路后增強(qiáng)了HGF誘導(dǎo)的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)了疾病的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤惡性程度加劇。谷光福等[17]研究證實(shí)胃癌發(fā)生后MACC1、HGF、c-Met的表達(dá)水平明顯增高，還會(huì)參與到疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，與TNM分期、分化程度及浸潤(rùn)深度關(guān)系密切，能夠與本研究結(jié)果相互印證。

本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株MKN45中MACC1 mRNA表達(dá)水平顯著高于胃癌細(xì)胞株MKN28，因此篩查、重組MACC1穩(wěn)定表達(dá)的胃癌細(xì)胞株或可為MACC1相關(guān)胃癌轉(zhuǎn)移模型的建立以及MACC1在胃癌中的動(dòng)態(tài)觀察提供幫助。既往研究已證實(shí)c-Met與胃癌肝轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[18]。本研究發(fā)現(xiàn)MACC1與HGF、c-Met呈正相關(guān)，因此在后續(xù)的臨床工作中可對(duì)癌組織內(nèi)的MACC1、HGF、c-Met進(jìn)行檢查，或可為胃癌診療工作開展及胃癌新藥研制提供新的靶點(diǎn)。

綜上所述，胃癌組織內(nèi)MACC1呈高表達(dá)，MACC1、HGF、c-Met陽性檢出率高，MACC1、HGF、c-Met均參與到胃癌的發(fā)生、進(jìn)展中，且MACC1與HGF、c-Met間關(guān)系密切，值得臨床醫(yī)師關(guān)注。