時(shí)運(yùn)， 王卓

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)是甲狀腺癌中最常見的病理類型，占所有甲狀腺癌的85%～90%[1]。BRAF V600E基因突變是PTC最常見的驅(qū)動(dòng)基因突變位點(diǎn)。其為BRAF基因第1 799位點(diǎn)的胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A)替代，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600位的賴氨酸(V)被谷氨酸(E)替代。近來的研究顯示，BRAF V600E基因突變與PTC的不良臨床病理學(xué)因素及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2]，并且可以輔助甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別[3-6]。目前，BRAF V600E基因突變檢測(cè)的方法很多[7-9]，但Sanger測(cè)序法依然是“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技術(shù)是近年來引入國(guó)內(nèi)的一種新型檢測(cè)方法，其具有高靈敏度，重復(fù)性好且可絕對(duì)定量等特點(diǎn)。本研究利用ddPCR技術(shù)與Sanger測(cè)序法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌患者BRAF V600E基因突變，并加以分析對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2017年1月1日至2019年9月1日江蘇省腫瘤醫(yī)院收治手術(shù)，經(jīng)病理診斷為PTC的術(shù)后甲醛固定后石蠟包埋樣本90例為病例組，其中男36例，女54例，年齡17～72歲，中位年齡52歲。以病理診斷為甲狀腺良性病變的術(shù)后甲醛固定后石蠟包埋樣本19例為對(duì)照組，其中男8例，女11例，年齡28～56歲，中位年齡45歲。患者臨床特征信息見表1。TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)最新版(第8版)。本研究所有患者均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 90例PTC患者臨床特征資料[例(%)]

1.2 DNA提取 按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒(批號(hào)148030295，德國(guó)凱杰公司)說明書操作，提取DNA。采用Onedrop OD-1000+spectrophotometer檢測(cè)儀檢測(cè)提取DNA的濃度和純度。瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的片段化程度。

1.3 Sanger測(cè)序法檢測(cè)BRAF V600E基因突變 運(yùn)用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增BRAF基因目的片段，擴(kuò)增引物如表2所示。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。按照Cycle-Pure Kit 純化試劑盒(批號(hào)D6492-02，美國(guó)Omega Biotek公司)說明書操作，純化PCR產(chǎn)物。采用Big Dye Terminator v3.1 kit (批號(hào)1803136, 美國(guó)賽默飛世爾公司)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)(測(cè)序引物同擴(kuò)增引物)，隨后純化，運(yùn)用ABI 3500基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。

表2 Sanger測(cè)序法和ddPCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變引物

1.4 ddPCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變 ddPCR法反應(yīng)體系為：20 ng DNA, 1×ddPCR supermix (no dUTP), 0.5 μmol/L 引物，0.25 μmol/L探針，總體積20 μl。采用QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min (1個(gè)循環(huán)), 94 ℃ 30 s ，55 ℃ 1 min (40個(gè)循環(huán))， 98 ℃ 10 min(1個(gè)循環(huán)，2 ℃/s的升溫速率)，最后4 ℃ 保溫(1 ℃/s的降溫速率)。采用QuantaSoft v1.6.6 analysis software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，閾值的確定依據(jù)“Droplet Digital Application Guide” (美國(guó)Bio-Rad公司)。陽性判定：“ch1+ch2-”區(qū)的點(diǎn)≥3個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 Sanger測(cè)序法和ddPCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變的比較 90例PTC標(biāo)本中，Sanger測(cè)序法檢測(cè)出48例BRAF V600E基因突變(如圖1所示)，檢出率53.33%，ddPCR法檢測(cè)出66例BRAF V600E基因突變(如圖2所示)，檢出率73.33%。兩種檢測(cè)方法比較，有18例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果不一致，均為ddPCR法檢測(cè)為突變型，而Sanger測(cè)序法檢測(cè)為野生型。與“金標(biāo)準(zhǔn)”Sanger測(cè)序法相比，采用ddPCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變敏感性和特異性分別為100%和57.14%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為72.73%和100.00%，兩種方法一致率為80%。在19例甲狀腺良性病變標(biāo)本中，Sanger測(cè)序法和ddPCR法均未檢出BRAF V600E基因突變。

注：1A為BRAF V600E基因野生型；1B為BRAF V600E基因突變型圖1 Sanger測(cè)序法檢測(cè)BRAF V600E基因突變的結(jié)果示意圖

注:2A為BRAF V600E基因野生型；2B為BRAF V600E基因突變型。圖中黑色代表不含目的片段DNA的微滴，綠色代表含野生型目的片段DNA的微滴，藍(lán)色代表含突變型目的片段DNA的微滴黃色代表既含野生型又含突變型目的片段DNA的微滴。圖2 ddPCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變的結(jié)果示意圖

2.2 PTC患者BRAF V600E基因突變豐度分布 采用ddPCR法檢測(cè)，66例檢出BRAF V600E基因突變的樣本中，基因突變豐度分布范圍0.35%～47.50%。其中，68.18%的樣本(45/66)基因突變豐度≥10%，9.09%的樣本(6/66)基因突變豐度在5%～10%，22.73%的樣本(15/66)基因突變豐度≤5%。ddPCR法檢測(cè)基因突變豐度≥10%的全部45例樣本，基因突變豐度在5%～10%的3例樣本，采用Sanger測(cè)序法均檢測(cè)出BRAF V600E基因突變。其余樣本采用Sanger測(cè)序法未檢出BRAF V600E基因突變。

3 討論

BRAF基因位于RET和RAS的下游，是RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵基因之一。BRAF基因 V600E 突變約占所有BRAF基因突變的95%[11]。BRAF V600E基因突變目前已廣泛應(yīng)用于甲狀腺癌的術(shù)前診斷和預(yù)后評(píng)估，并且作為潛在的治療靶點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注[1]。

Sanger測(cè)序法被認(rèn)為是基因檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其廣泛應(yīng)用于BRAF V600E基因突變的臨床檢測(cè)，但其存在檢測(cè)靈敏度不高的問題，實(shí)際檢測(cè)中易產(chǎn)生假陰性。ddPCR是近年來新發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，其無需校準(zhǔn)物和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品初始濃度的絕對(duì)定量，比傳統(tǒng)熒光定量PCR具有更加出色的靈敏度、特異性和精確性[12]。ddPCR技術(shù)在PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行分析，通過泊松分布原理計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元格的平均濃度，檢測(cè)數(shù)萬個(gè)微滴。ddPCR技術(shù)在腫瘤相關(guān)的分子檢測(cè)領(lǐng)域已有眾多應(yīng)用[13-14]。由于檢測(cè)方法，取材等因素的差異，PTC患者BRAF V600E突變檢出率不盡相同，突變檢出率范圍29%～90%[10,15-17]。本研究中的突變檢出率在此范圍內(nèi)。本研究中，ddPCR法檢測(cè)BRAF V600E基因突變檢出率明顯高于Sanger測(cè)序法，顯示出ddPCR法高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。

此前的研究認(rèn)為，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的突變僅發(fā)生在腫瘤組織中,BRAF V600E突變僅發(fā)生在PTC組織中，[18-21]。但近來不斷有研究指出，正常組織中也會(huì)存在腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的突變。丁金旺等[22]研究結(jié)果顯示采用擴(kuò)增阻滯突變法在115例甲狀腺良性病變組織中檢測(cè)出2例BRAF V600E突變。本研究受限于樣本數(shù)，ddPCR法和Sanger測(cè)序法均未在甲狀腺良性病變組織中檢測(cè)出BRAF V600E突變。

McEvoy等[23]指出，使用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)突變豐度在5%～8%的樣品時(shí)，需要采用其他檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)高突變豐度的樣品時(shí)，檢測(cè)結(jié)果和ddPCR法一致。而檢測(cè)低突變豐度的樣品時(shí)，僅部分BRAF V600E基因突變的樣品可以檢出。Sanger測(cè)序法無法檢出突變豐度≤5%的樣品。因此在檢測(cè)腫瘤DNA含量和突變豐度較低的樣品時(shí)，Sanger測(cè)序法有可能產(chǎn)生假陰性，需采用其他檢測(cè)方法。

本研究采用的標(biāo)本均為手術(shù)后石蠟包埋樣本。而目前，BRAF V600E突變檢測(cè)標(biāo)本部分來源于甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué) 標(biāo)本和粗針穿刺活檢標(biāo)本。此類樣本普遍腫瘤細(xì)胞含量較石蠟包埋樣本低，需要采用ddPCR法、 ARMS法等高靈敏度的檢測(cè)方法。采用傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法可能產(chǎn)生更多的假陰性。

綜上，ddPCR法檢測(cè)PTC患者BRAF V600E突變，靈敏度好，檢出率更高，適合檢測(cè)腫瘤DNA含量和突變豐度較低的樣品。可替代Sanger測(cè)序法，在臨床檢測(cè)中應(yīng)用推廣。