關(guān)利平，王玲玲，曹 珂，王力榮

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 450009）

我國是桃屬植物的起源中心，種質(zhì)資源非常豐富。桃在我國有近5 000 年的栽培歷史，各地交流頻繁，大多數(shù)品種差異不甚明顯，造成同物異名、同名異物現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生[1]。因此，迫切需要建立一套快速、準(zhǔn)確的桃品種鑒定技術(shù)體系，為桃知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐，這對桃種質(zhì)資源保存、開發(fā)利用及提高育種效率等具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）推薦SSR（simple sequence repeat）和SNP（single nucleotide polymorphism）作為指紋圖譜構(gòu)建的標(biāo)記方法。其中，SSR 標(biāo)記由于技術(shù)成熟、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)及成本低等特點(diǎn)，已對蘋果[2]、梨[3]、棗[4]等物種的全基因組SSR 進(jìn)行了全面的解析。

目前，國內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)在桃上開展了大量關(guān)于SSR 標(biāo)記開發(fā)和指紋圖譜構(gòu)建的研究。如Yoon等[5]從已發(fā)表的108 個(gè)SSR 位點(diǎn)中篩選出33 個(gè)，對96 份桃及油桃進(jìn)行鑒定；陳昌文等[6]利用BPPCT、UDP 等80 對SSR 引物，對237 份中國桃地方品種、育成品種及其野生近緣種進(jìn)行鑒定，篩選出8 對引物，使176 份種質(zhì)具有可分辨的分子身份證；Bouhadida 等[7]篩選出15 對SSR 引物，對94 份桃種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明其中的8 對引物可以有效區(qū)分所有種質(zhì)；Cao 等[8]從桃全基因組上篩選出53 對SSR 引物，對104 份中國桃地方品種進(jìn)行鑒定；王清明等[9]選用35 對已發(fā)表的SSR 引物構(gòu)建了22 份觀賞桃的指紋圖譜。雖然上述SSR 標(biāo)記在桃指紋圖譜構(gòu)建上得到了廣泛應(yīng)用，但按照傳統(tǒng)的方法，這些SSR 標(biāo)記的開發(fā)不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、效率低且缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

隨著桃基因組測序完成，使得從全基因組開發(fā)SSR 標(biāo)記成為可能，且基于桃的全基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR 標(biāo)記可能存在更高的多態(tài)性。因此，本研究以全基因組重測序獲得的SSR 標(biāo)記為基礎(chǔ)，從中篩選出10 對多態(tài)性高且重復(fù)性好的SSR 標(biāo)記用于指紋圖譜構(gòu)建和純度鑒定，為更好地研究和利用這些種質(zhì)材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣本采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家桃種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取

每個(gè)樣本采集新鮮幼嫩葉片2 g，用冰袋保存迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采用CTAB 法提取葉片基因組DNA。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，熒光標(biāo)記的正反向引物的混合物0.6 μL，DNA 樣品（20～30 ng/μL）1 μL，5U Taq DNA 聚合酶0.1 μL，超純水6.5 μL。

PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 產(chǎn)物檢測

等體積混合不同熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1 μL 加入到DNA 分析儀專用的96孔板中，每孔另外加入8.5 μL 去離子甲酰胺和0.5 μL ABI GeneScan 500LIZ分子量內(nèi)標(biāo)。將樣品在PCR儀上94 ℃變性3 min，將雙鏈變性成單鏈，迅速取出置于冰上冷卻10 min，瞬時(shí)離心10 s 后上機(jī)檢測。

參考機(jī)器操作標(biāo)準(zhǔn)，打開DNA 分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)。更換緩沖液，灌膠。將裝有樣品的深孔板置于樣品架基座上。打開數(shù)據(jù)收集軟件。按照儀器操作程序，制作板標(biāo)，輸入樣本編號或名稱。啟動程序，DNA 分析儀自動收集記錄毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)。

1.2.4 桃上已發(fā)表的SSR 篩選

從前人發(fā)表的具有高多態(tài)性的SSR引物中篩選出15 對，包括陳昌文等[6]發(fā)表的9 對（BPPCT008、CPPCT022、BPPCT017、UDP008、BPPCT020、UDP40、BPPCT034、CPPCT005、UDP409），Yoon 等[5]發(fā)表的5 對（CPPCT031、UDP001、BPPCT009、CPPCT003、CPPCT013）和Aranzana 等[10]發(fā)表的BPPCT015。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y 分別為該位點(diǎn)上2 個(gè)等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后。用POPGENE32 軟件計(jì)算每個(gè)SSR 位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)目（NA）、特異等位基因數(shù)目（NPA）、基因多樣性（GD）、多樣性指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1 15 對SSR 多態(tài)性比較

為評價(jià)Guan 等[11]基于全基因組重測序篩選的15 對SSR 引物的多態(tài)性，利用從已發(fā)表文獻(xiàn)中篩選出的15 對高多態(tài)性SSR 標(biāo)記，同時(shí)對36 份不同種質(zhì)類型桃品種進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。將上述2 組SSR標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行比較（表2）。結(jié)果表明這2 組SSR 標(biāo)記在供試的36 份種質(zhì)間分別檢測出等位基因171 個(gè)和153 個(gè)，平均每對引物檢測到11.4 個(gè)和10.2 個(gè)。從檢測到的等位基因數(shù)目來看，Guan 等[11]開發(fā)的SSR 標(biāo)記的多態(tài)性高于前人發(fā)表的。

表1 36 份不同種質(zhì)類型桃品種

表2 2 組SSR 的多態(tài)性比較

2.2 核心引物篩選

采用毛細(xì)管電泳方法，根據(jù)36 份不同種質(zhì)類型桃品種的15 對SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果，從中篩選出擴(kuò)增帶清晰、穩(wěn)定性強(qiáng)、容易識別的引物。最終從15 對SSR 引物中篩選出可用于桃品種鑒定的核心引物10 對，擴(kuò)增的條帶大小為100～300 bp（表3）。

表3 10 對核心SSR 引物的序列和位置信息

2.3 登記桃品種SSR 指紋圖譜構(gòu)建

《中華人民共和國種子法》規(guī)定品種需進(jìn)行DUS 測試才能登記、審定及保護(hù)，因此，需加強(qiáng)對登記品種的指紋圖譜構(gòu)建工作，為桃苗木認(rèn)證、品種登記和新品種保護(hù)提供理論技術(shù)支撐。本研究利用上述篩選出的10 對核心引物，對24 份登記品種進(jìn)行擴(kuò)增，獲得它們的真實(shí)擴(kuò)增片段大?。ū?）。對檢測的位點(diǎn)逐一進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)24 份登記品種的SSR 譜帶大小均不相同，即10 對SSR 核心引物能夠?qū)⑺械怯浧贩N區(qū)分開。

表4 24 份登記品種指紋圖譜

2.4 觀賞桃SSR 指紋圖譜構(gòu)建

觀賞桃以其花型多樣、花色豐富、花期長、色澤鮮艷等特點(diǎn)深受人民的喜愛。目前，花卉市場品種混雜，“同物異名”和“同名異物”現(xiàn)象常有發(fā)生。本研究基于上述開發(fā)的10 對核心SSR 引物對31 份觀賞桃種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定，獲得它們的擴(kuò)增片段大小，對檢測的位點(diǎn)逐一進(jìn)行比對。結(jié)果顯示SSR標(biāo)記可將所有供試樣本清晰地區(qū)分開來。說明本研究所選標(biāo)記足以區(qū)分不同材料，利用SSR 標(biāo)記進(jìn)行觀賞桃分子鑒定具有較強(qiáng)的可靠性。另外，10 對引物構(gòu)建的觀賞桃DNA 分子身份證具有唯一性，可實(shí)現(xiàn)對供試觀賞桃品種的精確、快速鑒定（表5）。

表5 構(gòu)建31 份觀賞桃品種（系）的指紋圖譜

續(xù)表5

2.5 品種純度鑒定

桃樹除了無花粉品種外，有花粉的品種均可以自交結(jié)實(shí)，但在自交過程中容易受其他品種的花粉污染。

因此，加強(qiáng)對種質(zhì)純度的鑒定尤為重要。以40個(gè)‘中油蟠13 號’自交系后代為試材，從上述10對核心引物中隨機(jī)選擇5 對進(jìn)行擴(kuò)增。從擴(kuò)增結(jié)果看出（表6），‘中油蟠13 號’的1、30 號樣本均在SSR152 位點(diǎn)的等位變異相差2 bp，依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《桃品種鑒定SSR 分子標(biāo)記法》的判定方法，樣品間的差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為“近似樣品”。而樣本20、37 號在SSR184 位點(diǎn)的等位差異位點(diǎn)數(shù)均≥2，判定為“不同樣品”。說明‘中油蟠13 號’自交系后代純度為95%。

表6 10 對核心引物對40 個(gè)桃自交系后代純度的鑒定

3 討論與結(jié)論

3.1 引物多態(tài)性

擴(kuò)增結(jié)果表明，本研究篩選出的10 對核心引物的多態(tài)性比較豐富。陳霽等[12]利用16 對位于李屬植物上的SSR 標(biāo)記在42 份觀賞桃種質(zhì)中平均每對引物擴(kuò)增出的等位基因數(shù)是7.75 個(gè)；陳昌文等[6]篩選出16 對SSR 引物在237 份桃種質(zhì)中平均每對引物對品種擴(kuò)增的等位基因數(shù)是12.7 個(gè)，而本研究中平均每對引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)是11.4 個(gè)。但這并未反映本研究中的引物多態(tài)性的高低，只是驗(yàn)證了引物擴(kuò)增條帶數(shù)與種質(zhì)數(shù)量、遺傳背景等有關(guān)。本研究10 對引物的多態(tài)性條帶比率為98.02%，足見其多態(tài)性比較豐富。

3.2 核心引物選擇

選擇合適的引物組合是構(gòu)建桃分子身份證的重要前提。引物組合的大小反映出組合中引物自身的多態(tài)性，也可以反映組合對種質(zhì)的區(qū)分能力[13]。因此，核心引物的選擇至關(guān)重要。本研究用于篩選的15 對SSR 引物的多態(tài)性高于前人發(fā)表的[10]，且該引物均是基于重測序數(shù)據(jù)獲得的，在桃上具有較高的特異性。同時(shí)，依據(jù)等位基因大小進(jìn)行核心引物的篩選，既考慮了它們在品種間的多態(tài)性又兼顧引物組合的數(shù)量，但引物的多態(tài)性不等同于引物組合的多態(tài)性。通過“最優(yōu)組合”，本研究獲得10對多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清晰且區(qū)分能力最強(qiáng)的最少引物組合的SSR 標(biāo)記作為核心引物。

3.3 分子身份證的構(gòu)建

近幾年，研究者們分別構(gòu)建了蘋果[14]、梨[15]、葡萄[16]、草莓[17]、西瓜[18]等果樹的分子身份證。目前構(gòu)建分子身份證的編碼方法主要有3 類[19]。第1 類是根據(jù)標(biāo)記的有無，將圖譜轉(zhuǎn)化為1 和0 組成的字符串，即構(gòu)成分子身份證，但矩陣文件字段過長不利于數(shù)據(jù)間的比較；第2 類是將每對引物擴(kuò)增的條帶按從小到大排列，依次賦值，但忽略了品種相應(yīng)位點(diǎn)的真實(shí)帶型；第3 類是本研究所采用的，記錄每個(gè)位點(diǎn)原始帶型數(shù)據(jù)，能夠真實(shí)地反映品種的指紋信息，且在品種鑒定時(shí)往往是進(jìn)行相似品種個(gè)別位點(diǎn)間的比對，解決了上述方法中從分子身份證號碼回溯真實(shí)擴(kuò)增帶型的難題。

3.4 數(shù)據(jù)庫的可擴(kuò)充性

目前認(rèn)為SSR指紋圖譜技術(shù)是最為成熟的一項(xiàng)技術(shù)。然而，果樹種質(zhì)中存在大量的芽變及姊妹系品種，且每年選育的新品種都有近百個(gè)[20]，所以必須建立新品種的分子身份證來及時(shí)更新數(shù)據(jù)庫。理論上每對引物最多可以有3 種帶型（X/X、Y/Y、X/Y），所以利用所選的10 對引物最多可以區(qū)分59 049（310）個(gè)桃品種，可以滿足現(xiàn)在及將來對桃品種鑒定的要求。此外，隨著桃品種的不斷增多，本研究中利用的10 對核心引物可能不能將有些品種區(qū)分開，此時(shí)可從187 份引物[11]中繼續(xù)添加引物使用來進(jìn)行品種鑒定。