冉 飛，張榮全，袁 騰，馬繼玲，尹顯慧，李文志，樊 榮，吳小毛，龍友華

（1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025）（2 貴州大學(xué)獼猴桃工程技術(shù)研究中心）（3 水城縣東部農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)管理委員會）

獼猴桃屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），在我國資源極為豐富，有中華獼猴桃（Actinidia chinensis）、美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）、毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）、軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）等62 個種，其中美味獼猴桃和中華獼猴桃栽培利用最為廣泛[1-3]?！t陽’（Actinidia chinensis cv.Hongyang）屬中華獼猴桃系列，是一個早熟品種，原產(chǎn)于四川省蒼溪縣，其果實皮薄肉多，香甜可口，果肉顏色鮮美，營養(yǎng)價值豐富[4]，現(xiàn)已列入“國家級品種保護(hù)資源”[5]。隨著市場需求的擴(kuò)大，‘紅陽’獼猴桃在貴州省六盤水地區(qū)發(fā)展迅速，品質(zhì)優(yōu)良，果大端正，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)特色水果[6]。但近幾年來，該地區(qū)‘紅陽’獼猴桃受褐斑病危害極為嚴(yán)重，葉片常干枯卷曲，嚴(yán)重時可致落葉落果，甚至整株枯死，對‘紅陽’獼猴桃優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。

植物褐斑病為一種真菌性病害，關(guān)于其病原菌的研究主要有危害白及葉片的燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[7]、危害冬瓜葉片的多主棒孢［Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei］[8]、危害核桃果實的鏈格孢菌（Alternaria alternate）[9]、危害茶葉的格孢腔菌屬真菌（Pleospora camelliae Dippen ）[10]、危害葡萄的葡萄擬尾孢菌（Pseudocercospora vitis）[11]、危害地錦葉片的地錦葉點霉（Phyllosticta partricuspidatae）[12]等。目前關(guān)于貴州省‘紅陽’獼猴桃病原菌的研究，有雷霽卿等[13]報道了危害六盤水地區(qū)‘紅陽’獼猴桃果實軟腐病的病原菌有葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.）、交鏈孢菌（Alternaria sp.）、擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）、小新殼梭孢菌（Neofusicoccum sp.）及間座殼菌（Diaporthe sp.），Li 等[14]雖將六盤水地區(qū)‘紅陽’獼猴桃葉片上的褐斑病菌鑒定為 Alternaria tenuissima，但尚未對該病菌開展室內(nèi)毒力試驗。鑒于此，篩選出高效、低毒的化學(xué)藥劑防治‘紅陽’獼猴桃褐斑病至關(guān)重要。本研究采取形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對貴州省六盤水地區(qū)‘紅陽’獼猴桃褐斑病菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并采用菌絲生長速率法研究6 種藥劑對病原菌的抑菌作用，以期為更好地防控‘紅陽’獼猴桃褐斑病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病樣

于2019 年7—10 月，多次在貴州省六盤水地區(qū)采集典型病葉，帶回實驗室置于4 ℃保存，并于24 h 內(nèi)進(jìn)行病原菌分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[15]，用于病原菌的分離、純化培養(yǎng)及室內(nèi)毒力試驗。

1.1.3 主要試劑

CTAB 提取液，Taq DNA 聚合酶，引物ITS1（TC CGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTAT TGATATGC）、EF1-728F（CATCGAGAAGTTCGAGA AGG）、EF1-986R（TACTTGAAGGAACCCTTACC）、H31-a（ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG）和H31-b（GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT）等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

1.1.4 供試藥劑

97%戊唑醇、96%吡唑醚菌酯、95%苯醚甲環(huán)唑、97%咪鮮胺、96%肟菌酯和96%異菌脲，以上原藥均購自湖北正興源精細(xì)化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃褐斑病病原菌分離、純化及致病力測試

選取典型病害癥狀葉片，用滅菌過的剪刀取其病健交界處4 mm×4 mm 大小的組織塊，先用75%酒精浸泡10～20 s，去除表面張力，隨后放入10%次氯酸鈉消毒1～2 min，再用無菌水清洗3 次，最后用無菌濾紙吸干水分并移入PDA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d 后，挑取典型單菌落邊緣菌絲于PDA 平板上進(jìn)行多次純化培養(yǎng)，待菌落為純種后，采用30%甘油進(jìn)行冷凍保存。選取健康獼猴桃葉片，標(biāo)記接種點，用滅過菌的小刀在接種點輕輕刮傷，再將已培養(yǎng)好的菌株用滅過菌的7 mm 打孔器打成菌餅，用接種針挑取菌餅菌絲面緊貼于葉片，葉柄用無菌水浸濕的棉花包裹，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察葉片生長情況。待葉片發(fā)病后，對發(fā)病組織進(jìn)行再次分離純化，并與原接種菌進(jìn)行比對。

1.2.2 病原菌培養(yǎng)特征和顯微結(jié)構(gòu)觀察

將已純化菌株轉(zhuǎn)接于PDA 平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，參照《真菌鑒定手冊》[16]觀察菌落形態(tài)、顏色及生長速度等特征，并在顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)和產(chǎn)孢情況。

1.2.3 病原菌總DNA 的提取

采用改良 CTAB 法提取病原菌的基因組DNA[17]。

1.2.4 PCR 序列擴(kuò)增

采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成的ITS1 和ITS4、EF1-728F 和EF1-986R、H31-a 和H31-b 3 對引物分別對病原真菌的rDNA-ITS、TEF1-α 和Histone 3 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測序工作。

40 μL PCR 反應(yīng)體系：2×Taq PCR StarMix 20 μL，正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 14 μL。

PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（rDNA-ITS：58 ℃，TEF1-α：56 ℃，Histone 3：55 ℃），72 ℃延伸60 s，共32個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析

將獲得的各基因序列提交至 NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對分析，使用PAUP 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 病原菌防治藥劑室內(nèi)篩選

根據(jù)預(yù)期試驗結(jié)果，利用母液稀釋法將各供試原藥配成5 個有效濃度，戊唑醇終濃度為3.233 3、1.077 8、0.359 3、0.119 8、0.039 9 mg/L，吡唑醚菌酯終濃度為3.200 0、1.066 7、0.355 6、0.118 5、0.039 5 mg/L，苯醚甲環(huán)唑終濃度為9.500 0、1.055 6、0.117 3、0.013 0、0.001 4 mg/L，咪鮮胺終濃度為0.692 9、0.099 0、0.014 1、0.002 0、0.000 3 mg/L，肟菌酯終濃度為19.200 0、1.476 9、0.113 6、0.008 7、0.000 7 mg/L，異菌脲終濃度為0.640 0、0.320 0、0.160 0、0.080 0、0.040 0 mg/L，備用。將PDA 培養(yǎng)基加熱熔解，待冷卻至手可以觸碰時，將PDA 培養(yǎng)基與藥劑以9∶1 的比例混合，并倒于培養(yǎng)皿中冷卻凝固。用接種針挑取7 mm 已活化菌餅的菌絲面緊貼于含藥平板中央，密封。以不加藥劑但含等量溶劑的PDA 平板為對照，每處理4 次重復(fù)。將接種好的含藥平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待對照組菌落生長至整個培養(yǎng)皿的2/3 時，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算平均值和抑菌率。

根據(jù)各藥劑濃度和抑菌率在DPS 7.05 統(tǒng)計軟件中求出各藥劑的毒力回歸方程（y＝ax＋b）、相關(guān)系數(shù)（r）和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃褐斑病癥狀特征和分離結(jié)果

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，褐斑病主要危害‘紅陽’獼猴桃的葉片，通常從葉片的邊緣開始侵染，初期為淡褐色斑點，中期病斑逐漸擴(kuò)大為近圓形或不規(guī)則形病斑，病斑中部灰褐色，外圍褐色或深褐色，后期多個病斑融合成大片不規(guī)則形，并從葉片邊緣逐漸干枯卷曲，最終脫落（圖版3-A）。通過傳統(tǒng)的組織分離法從病葉典型病斑處分離獲得2 株真菌，分別標(biāo)記為HBB-5、HBB-8。

2.2 病原菌致病性驗證

根據(jù)柯赫氏法則將HBB-5 和HBB-8 2 株真菌分別刺傷接種于離體葉片上，通過觀察可知僅有HBB-8 能使葉片發(fā)病，而HBB-5 和對照組在整個培養(yǎng)過程中均不發(fā)病。HBB-8 接種于葉片上7 d 后出現(xiàn)可見癥狀（圖版3-B），其發(fā)病特征與田間癥狀特征一致，并對葉片發(fā)病部位進(jìn)行了再次分離純化培養(yǎng)。通過形態(tài)特征和顯微結(jié)構(gòu)觀察，分離出的菌株與原接種的菌株HBB-8 一致，符合柯赫氏法則，由此表明HBB-8 為引起‘紅陽’獼猴桃褐斑病的致病菌。

2.3 病原菌形態(tài)觀察

菌株在PDA 培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，菌落初期為白色，圓形生長，邊緣整齊，2 d 后菌落內(nèi)圍顏色逐漸加深，后期變?yōu)榛疑梁诤稚鈬詾榘咨?，培養(yǎng)7 d 后菌落平均直徑為6.53 cm，其氣生菌絲茂密，呈絨狀（圖版3-C-a、b）；分生孢子卵形或倒棍棒形，黃褐色至褐色，具1～4 個橫隔膜，0～2個縱（斜）隔膜，大小為10.02～23.14 μm×4.32～11.25 μm（圖版3-C-c、d）；分生孢子梗直立或稍彎曲，暗色，單支，頂生分生孢子（圖版3-C-e、f）。根據(jù)菌株HBB-8 的形態(tài)特征觀察，初步鑒定該致病菌為鏈格孢屬真菌[18-20]。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

使用真菌通用引物ITS1、ITS4 擴(kuò)增菌株HBB-8的rDNA-ITS 區(qū)域，獲得539 bp 大小的DNA 片段，序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對分析（ITS：GenBank 登錄號為MT358396），發(fā)現(xiàn)菌株屬于鏈格孢菌（Alternaria spp.），再通過系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，菌株與細(xì)極鏈格孢 A.tenuissima（MN658846、MN685225）和鏈格孢A.alternata（MN659182、MN653245）2 個種以100%的自展支持率聚在同一分支，其他不同屬種則聚在各自的分支上，由此表明，使用rDNA-ITS 基因鑒定不能將A.tenuissima 和A.alternata 2 個種區(qū)分開來（圖1）。采用鏈格孢屬真菌常用基因TEF1-α 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并比對，HBB-8（TEF1-α：GenBank 登錄號為MW419902）與細(xì)極鏈格孢菌株 A.tenuissima（LC136865、LC136863、LC136862 等）的同源性均達(dá)到100%，在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中也與 A.tenuissima 聚在同一分支（圖2）。再利用另一對引物H31-a 和H31-b 對Histone 3 保守基因進(jìn)行擴(kuò)增，由系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株HBB-8（Histone 3：GenBank 登錄號為MT361348）與A.tenuissima 以很高的支持率聚在一起，而A.alternata 則聚在另一分支上（圖3）。

圖1 菌株HBB-8 基于rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 菌株HBB-8 基于TEF1-α序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株HBB-8 基于Histone 3 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，最終明確危害‘紅陽’獼猴桃褐斑病的病原為細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）。

2.5 6 種藥劑對病原菌菌絲生長的抑制效果

離體抑菌活性測定結(jié)果表明，6 種不同藥劑均能有效抑制獼猴桃褐斑病菌菌絲的生長，其抑菌活性由強至弱依次為咪鮮胺＞苯醚甲環(huán)唑＞戊唑醇＞異菌脲＞肟菌酯＞吡唑醚菌酯，見表1。咪鮮胺在供試6 種藥劑中對褐斑病菌的抑菌活性最強，EC50為0.008 4 mg/L，其次為苯醚甲環(huán)唑，EC50為0.055 3 mg/L。戊唑醇、異菌脲和肟菌酯3 種藥劑對褐斑病菌菌絲生長具有較好的抑制作用，EC50分別為0.163 6、0.164 3、0.168 2 mg/L。吡唑醚菌酯的抑菌效果相對較差，EC50為0.413 7 mg/L。由此可得，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑2 種藥劑對褐斑病菌具有較強的抑制效果，值得用于田間防治該病害。

表1 6 種藥劑對細(xì)極鏈格孢菌的抑制效果

3 討論與結(jié)論

鏈格孢屬（Alternaria）真菌適應(yīng)性強，寄主范圍廣，為許多重要植物褐斑病的病原菌，如柑橘[19]蘋果[21]、獼猴桃[18]、核桃[9]、甜葉菊[22]等。鏈格孢屬、小孢子種為一類近似種，僅依靠形態(tài)觀察與ITS 序列分析很難明確其具體分類地位[23]。本研究對病原菌的孢子形態(tài)和隔膜特征等形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與趙金梅等[18]、李亞等[19]描述的鏈格孢屬真菌基本一致。采用ITS 結(jié)合TEF1-α 和Histone 3 基因?qū)Σ≡M(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，危害‘紅陽’獼猴桃褐斑病的病原菌與細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）聚在一起，鑒定結(jié)果與Li 等[14]研究結(jié)果一致。

褐斑病為獼猴桃的主要病害之一，能貫穿于獼猴桃的整個生長季節(jié)，目前生產(chǎn)上對該病害的防控主要以化學(xué)防治為主。本研究以6 種保護(hù)性殺菌劑原藥為供試藥劑，采用菌絲生長速率法探究其對獼猴桃細(xì)極鏈格孢菌的抑菌效果。試驗結(jié)果表明，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、異菌脲、肟菌酯和吡唑醚菌酯6 種藥劑均具有較強的抑菌活性，其中咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抑菌活性最強，其EC50分別為0.008 4、0.055 3 mg/L。據(jù)報道，400 g/L 氟硅唑乳油、500 g/L 異菌脲懸浮劑、10%多抗霉素B 可濕性粉劑和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對中華獼猴桃褐斑病鏈格孢菌（A.alternata）具有較強的抑菌效果[18]；25%苯醚甲環(huán)唑乳油、25%咪鮮胺乳油、25%丙環(huán)唑乳油、25%嘧菌酯懸浮劑和80%代森錳鋅可濕性粉劑對獼猴桃葉斑?。≒seudocercospora actinidiae Deighton、Phyllosticta sp.）均具有較高的抑菌活性[24]；咪鮮胺錳鹽、戊唑醇、氟硅唑、吡唑醚菌酯、丙環(huán)唑、異菌脲對‘紅陽’獼猴桃葉斑病菌（Corynespora sp.）菌絲生長有較強的抑制作用[25]。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果基本吻合。但本試驗只在室內(nèi)測定了咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)职卟【休^強的抑菌作用，對于大田防控效果，還有待進(jìn)一步研究。

咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑同為DMI 類殺菌劑，低毒、高效、殺菌譜廣，通過破壞或抑制病菌麥角甾醇的合成，使菌體的細(xì)胞膜功能受到損壞，從而達(dá)到抑制或干擾病菌孢子和菌絲的形成[26-27]，對多種真菌病害具有較高的保護(hù)和治療活性[28-29]。本試驗也驗證了咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑2 種藥劑對細(xì)極鏈格孢菌具有較強的抑制效果。但目前果樹生產(chǎn)上存在諸多問題，如用藥盲目、農(nóng)殘超標(biāo)、環(huán)境污染等[30]，為此應(yīng)加強褐斑病發(fā)病規(guī)律和病菌致病機(jī)理的研究，研發(fā)有效生物藥劑，篩選高效拮抗菌株，并結(jié)合農(nóng)業(yè)防治措施，開展獼猴桃病蟲害綠色防控。