鄢海峰，周宗山

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，遼寧興城 125100）

蘋果斑點落葉病是世界范圍內(nèi)蘋果重要病害之一，在我國各個蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。蘋果斑點落葉病主要危害蘋果葉片，也危害新梢和果實，是‘新紅星’等元帥系蘋果的重要病害，在持續(xù)降雨及雨后濕度大的天氣容易暴發(fā)[2-3]，嚴(yán)重時影響樹勢及花芽形成，并且造成大量落葉，影響果實膨大和著色。在發(fā)病后期，病菌可以侵染果實，致使果實品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。蘋果斑點落葉病由鏈格孢蘋果?；停ˋlternaria alternata f.sp.mali）引起[7]，殺菌劑抗藥性行動委員會（FRAC）將Alternaria alternata 歸類為對殺菌劑有很高抗藥性風(fēng)險的植物病原菌，對生產(chǎn)中使用殺菌劑產(chǎn)生抗藥性有高風(fēng)險[8]。雖然抗性品種是防控該類病害的最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法，但在缺少抗性品種或抗性不完整的情況下，使用化學(xué)藥劑仍是防控作物真菌病害的主要手段[9]。

戊唑醇是麥角甾醇抑制類（sterol demethylation inhibitors，DMIs）殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，兼具有保護(hù)、治療的作用[10]?？顾幮燥L(fēng)險評估研究表明，蘋果斑點落葉病菌對戊唑醇敏感性研究結(jié)果有差異，且隨著用藥時間的延長，菌株對藥劑的敏感性下降[11-12]。二甲酰亞胺類（dicarboximides，DCs）包括異菌脲和腐霉利等，是20 世紀(jì)后期開發(fā)的一類觸殺型保護(hù)性殺菌劑，也具有一定的治療作用，可有效抑制真菌孢子萌發(fā)及菌絲生長[13]。二甲酰亞胺類殺菌劑的廣泛應(yīng)用，很容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且抗藥性形成時間短、頻次高[14]，已有DCs殺菌劑在多種病害上產(chǎn)生抗藥性的報道[15-18]。吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯類（quinone outside inhibitors，QoIs）殺菌劑，主要是抑制病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長所需能量的產(chǎn)生，具有內(nèi)吸活性，殺菌譜廣且高效低毒，有保護(hù)、治療、鏟除功能，但作用位點單一，屬“高抗性風(fēng)險”藥劑[19]。在大量使用該農(nóng)藥的作物上，抗性發(fā)展極為迅速[20]。

為延緩病菌對殺菌劑的抗藥性產(chǎn)生，開展預(yù)防性抗性治理，盡可能延長殺菌劑的使用壽命，采用不同作用機(jī)制的殺菌劑交替或復(fù)配使用是延緩或阻止病原菌抗藥性加劇的主要策略之一[21]。復(fù)配殺菌劑能形成多位點作用機(jī)制，除了保護(hù)和延長高效中到高抗性風(fēng)險殺菌劑的壽命外，復(fù)配殺菌劑還提供了額外的疾病控制水平和范圍[22-23]。在一些作物中，復(fù)配劑的使用在病害防治中發(fā)揮著越來越重要的作用，以維持有效的病害控制和抗性管理[24]。為此，本研究開展了篩選異菌脲與戊唑醇、異菌脲與吡唑醚菌酯2 種復(fù)配劑的增效比例，探明戊唑醇與異菌脲、吡唑醚菌酯與異菌脲2 種復(fù)配對蘋果斑點落葉病菌是否具有增效作用，通過聯(lián)合毒力測定，最終選出2 種混劑的最佳配比，為研制防治蘋果斑點落葉病菌的混配藥劑提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌珠

蘋果斑點落葉病菌（Alternaria alternata f.sp.mali）菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所植物保護(hù)中心分離、保存。

1.2 試驗藥劑

97%異菌脲（iprodione）原藥、85%戊唑醇（tebuconazole ）原藥和95% 吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）原藥由沈陽化工研究院司乃國研究員饋贈；500 g/L 異菌脲可濕性粉劑由富美實有限公司生產(chǎn)；430 g/L 戊唑醇懸浮劑由山東煙臺科達(dá)化工有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 室內(nèi)毒力測定

（1）單劑毒力測定。采用菌絲生長速率法測定蘋果斑點落葉病菌對異菌脲、戊唑醇、吡唑醚菌酯3 種單一藥劑的敏感性。異菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯原藥用二甲基亞砜（DMSO）配制成母液備用，將PDA 培養(yǎng)基熔化，冷卻至50 ℃時加入殺菌劑充分混勻，配制含異菌脲5、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL 系列濃度的PDA 平板，含戊唑醇10、5、1、0.5、0.25 μg/mL 系列濃度的PDA 平板，含吡唑醚菌酯20、10、5、1、0.5、0.25 μg/mL 系列濃度的PDA平板，以不含藥劑的PDA 平板作對照。在PDA 平板中央接種1 個直徑5 mm 的菌餅，每個處理重復(fù)4次，24 ℃下黑暗培養(yǎng)7 d，直角測量每個菌落直徑2 次，計算菌絲生長抑制率。

（2）最佳配比篩選。采用Horsfall 交互測定法進(jìn)行最佳配比的篩選[25]。異菌脲與戊唑醇2 種單劑用無菌水分別配制成劑量濃度與其EC50相同或相近的藥液，2 種藥液分別按體積比0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0 進(jìn)行復(fù)配，按照上述單劑毒力測定方法處理供試菌，以不含藥劑的PDA 平板作對照，共12 個處理，1 個PDA 平板為1 次重復(fù)，每個處理4 次重復(fù)，異菌脲與吡唑醚菌酯復(fù)配方法及處理同上，計算各復(fù)配藥劑的菌絲生長抑制率及毒性比率。

毒性比率小于0.75 時，表現(xiàn)為拮抗作用；毒性比率在0.75～1.25 時，表現(xiàn)為相加作用；毒性比率大于1.25 時，表現(xiàn)為增效作用。根據(jù)毒性比率初步篩選出最佳配比。

（3）混配殺菌劑聯(lián)合毒力測定。根據(jù)不同比例復(fù)配殺菌劑的毒力結(jié)果篩選出的最佳配比，對蘋果斑點落葉病菌分別取異菌脲與戊唑醇EC50值劑量比例為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，異菌脲與吡唑醚菌酯EC50值劑量比例為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1各4 個比例作聯(lián)合毒力驗證，采用Wadley 法進(jìn)行評價[26]。

EC50（A）、EC50（B）分別代表混劑中A 藥劑和B 藥劑的EC50實測值；EC50（ob）、EC50（th）分別代表混劑的EC50實測值和理論值；PA、PB分別代表A 藥劑和B藥劑在混劑中的百分含量，單位為%；SR 代表增效系數(shù)，SR＞1.5 為增效作用，1.5≥SR≥0.5 為相加作用，SR＜0.5 為拮抗作用。

1.3.2 田間藥效試驗

2020 年，在遼寧省興城市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所溫泉試驗場蘋果園進(jìn)行田間藥效試驗。試驗園為平地，管理一般，蘋果品種為‘金冠’，行株距5 m×3 m，樹齡6 年，樹勢中庸，蘋果斑點落葉病常年發(fā)生。

試驗藥劑為500 g/L 異菌脲可濕性粉劑和430 g/L 戊唑醇懸浮劑的混合物（異菌脲與戊唑醇的質(zhì)量比為4∶1），濃度分別為3 000 倍液、4 000 倍液、5 000 倍液，對照藥劑為500 g/L 異菌脲懸浮劑1 500倍液和430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液，以清水處理為空白對照。試驗共設(shè)6 個處理，3 株蘋果樹為1 個試驗小區(qū)，每個處理3 次重復(fù)，共18 個小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組安排。用利農(nóng)手壓背負(fù)式噴霧器全樹噴霧，均勻噴灑。

葉片發(fā)病初期噴第1 次藥，噴藥前調(diào)查發(fā)病基數(shù)，共施藥5 次，間隔7 d，最后1 次噴藥后7 d 調(diào)查防效。病葉分級標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則》[27]，每小區(qū)隨機(jī)選取10 個新梢，每個新梢自上而下調(diào)查全部葉片，記錄總?cè)~片數(shù)、各級病葉數(shù)，計算病情指數(shù)和防治效果。對防效進(jìn)行方差分析（SPSS 統(tǒng)計軟件），采用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）檢驗藥劑平均防效的差異顯著性。

CK 為空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)，PT 為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力測定

2.1.1 3 種殺菌劑對蘋果斑點落葉病菌的毒力

單劑毒力測定結(jié)果表明，異菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯3 種單劑對蘋果斑點落葉病菌菌絲生長均有良好的抑制作用，對蘋果斑點落葉病菌的EC50值分別為0.678 6、2.762 7、7.933 1 mg/L（表1）。

表1 異菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯對蘋果斑點落葉病菌的毒力

2.1.2 不同比例復(fù)配殺菌劑對蘋果斑點落葉病菌的毒力

復(fù)配劑毒力測定結(jié)果表明：異菌脲與戊唑醇EC50值劑量比例為6∶4、7∶3、8∶2 和9∶1 時，對蘋果斑點落葉病菌的毒性比率分別為1.35、1.45、1.50、1.41，表現(xiàn)為增效作用；比例為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 和5∶5 時，表現(xiàn)為相加作用。異菌脲與吡唑醚菌酯EC50值劑量比例為9∶1 時，對蘋果斑點落葉病菌的毒性比率為1.26，表現(xiàn)為增效作用；比例為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3 和8∶2 時，均表現(xiàn)為相加作用（表2）。

表2 異菌脲與戊唑醇、吡唑醚菌酯不同復(fù)配比例對蘋果斑點落葉病菌的毒性比率

2.1.3 最佳配比對蘋果斑點落葉病菌的聯(lián)合毒力

結(jié)果表明，異菌脲和戊唑醇不同配比的混合物對蘋果斑點落葉病菌表現(xiàn)不同程度的抑制作用，異菌脲和戊唑醇EC50值劑量比例為8∶2（實際含量比為4∶1）的增效系數(shù)為1.57，表現(xiàn)為增效作用；比例6∶4、7∶3 和9∶1 配比混劑對蘋果斑點落葉病菌的增效系數(shù)分別為1.27、1.42、1.29，表現(xiàn)為相加作用（表3）。

異菌脲與吡唑醚菌酯EC50值劑量比例6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 配比混劑對蘋果斑點落葉病菌的增效系數(shù)分別為1.09、1.12、1.14、1.41，均介于0.5～1.5 之間，表現(xiàn)為相加作用，其中比例9∶1 的增效系數(shù)明顯高于其他3 個配比（表3）。

表3 異菌脲與戊唑醇、吡唑醚菌酯不同復(fù)配比例對蘋果斑點落葉病菌的聯(lián)合毒力

2.2 田間防治效果

田間試驗表明：異菌脲與戊唑醇的復(fù)配劑（質(zhì)量比4∶1）中，稀釋倍數(shù)3 000 的防效最高，為78.90%，顯著高于稀釋倍數(shù)4 000、5 000 的防效和單劑對照500 g/L 異菌脲可濕性粉劑1 500 倍液、430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液的防效；異菌脲與戊唑醇的復(fù)配劑（質(zhì)量比4∶1）稀釋倍數(shù)4 000 和5 000的防效分別為73.24%、70.77%，二者差異顯著，也均顯著高于500 g/L 異菌脲可濕性粉劑1 500 倍液、430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液的防效（表4）。

表4 異菌脲與戊唑醇復(fù)配劑對蘋果斑點落葉病菌的田間防治效果

3 結(jié)論與討論

長期、連續(xù)地使用單一的殺菌劑會導(dǎo)致單一作用位點的殺菌劑更快地產(chǎn)生抗藥性，防治成本較高，并且可能致使病害的流行發(fā)展、嚴(yán)重的農(nóng)作物損失，最終導(dǎo)致生產(chǎn)中常用殺菌劑的失效[28]。為降低蘋果斑點落葉病菌對常用殺菌劑產(chǎn)生抗性的風(fēng)險，擴(kuò)大防治譜及降低使用成本，利用現(xiàn)有農(nóng)藥進(jìn)行混配是有效途徑之一[29]。因此，本試驗對2 種作用機(jī)制不同的殺菌劑的混配進(jìn)行研究，旨在增加藥效，延緩抗藥性的發(fā)生。

室內(nèi)聯(lián)合毒力測定結(jié)果表明，異菌脲與吡唑醚菌酯復(fù)配在所測的4 個EC50值劑量比均對蘋果斑點落葉病菌表現(xiàn)出相加作用，EC50值劑量比例為9∶1（實際含量比為1∶1）的增效系數(shù)最大。異菌脲和戊唑醇EC50值劑量比為8∶2（實際含量比為4∶1）的混合物，對抑制蘋果斑點落葉病菌菌絲的生長表現(xiàn)出明顯增效作用。田間藥效試驗結(jié)果表明，異菌脲與戊唑醇復(fù)配質(zhì)量比4∶1 時，3 000～5 000 倍液的防效顯著高于500 g/L 異菌脲可濕性粉劑1 500 倍液和430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液的防效，有效成分含量也更低，由此證明這2 種農(nóng)藥具有混配的可行性。

同時，有報道稱吡唑醚菌酯與戊唑醇復(fù)配對葡萄炭疽病的防治呈現(xiàn)了明顯增效作用[30]。吡唑醚菌酯與異菌脲的復(fù)配對防治蘋果褐斑病菌也表現(xiàn)增效作用[31]。異菌脲與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的復(fù)配與單劑相比增效明顯，且擴(kuò)大了殺菌譜[29]。本研究篩選了異菌脲與戊唑醇、異菌脲與吡唑醚菌酯復(fù)配增效比例，結(jié)果表明，異菌脲和戊唑醇以質(zhì)量比4∶1 復(fù)配時對蘋果斑點落葉病菌增效作用最高，對蘋果斑點落葉病的防效隨用藥濃度的增加而提高，推薦使用濃度3 000～4 000 倍液。