孫立方，徐建國，柯甫志

（浙江省柑橘研究所，國家柑橘品種改良中心浙江分中心，臺州 318026）

常規(guī)育種方法已成功地用于柑橘品種改良和新品種的培育，但由于柑橘植株大、童期長、雜交或自交不親和、遺傳雜合度高、多胚以及單性結(jié)實(shí)等特性給常規(guī)育種工作帶來很多困難和限制[1]。因此，常規(guī)育種很難在短期內(nèi)培育具有理想性狀的新品種。與常規(guī)育種相比，基因工程育種能高效地對植物進(jìn)行定向改良，縮短育種周期，逐漸成為柑橘定向育種和研究工作的重要手段。近10 余年來，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為主的基因工程育種在柑橘抗病育種、抗非生物逆境脅迫以及改良柑橘果實(shí)性狀等方面的研究已成功取得了一系列進(jìn)展[2-4]。

作為常規(guī)基因工程育種技術(shù)的核心，轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然可以調(diào)控植物中目標(biāo)基因的表達(dá)，但無法實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯，導(dǎo)致其在基因工程育種的應(yīng)用過程中受到了一定的限制[5]?；蚓庉嫾夹g(shù)是繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)之后興起的能夠?qū)μ囟ɑ蛭稽c(diǎn)實(shí)現(xiàn)精確編輯的一種基因修飾技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)為作物的遺傳改良和植物基因功能等研究提供了新的思路與途徑[6]。據(jù)報(bào)道顯示，作為目前最高效的基因組編輯工具，CRISPR/Cas 系統(tǒng)自2013 年首次被應(yīng)用于植物以來[7-8]，已經(jīng)成功在24 個(gè)科的45 個(gè)屬植物中應(yīng)用，包括模式植物、主要作物、園藝及藥用植物等[9]。本文介紹了基因編輯技術(shù)的發(fā)展過程以及CRISPR/Cas 系統(tǒng)的種類和技術(shù)優(yōu)勢，綜述了CRISPR/Cas 系統(tǒng)在柑橘基因工程育種等研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并對基因編輯系統(tǒng)目前在柑橘育種應(yīng)用中存在的問題以及未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了探討。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

基因編輯系統(tǒng)根據(jù)序列特異性核酸酶的不同，可以分為3 類：鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator like effector nuclease，TALENs）、基于Ⅱ型簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白開發(fā)的CRISPR/Cas 系統(tǒng)[10]。這3 類基因組編輯系統(tǒng)的作用原理類似，均首先在基因組中產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（DSB），然后通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）途徑修復(fù)，但由于這3 類核酸酶在結(jié)構(gòu)、活性和酶作用機(jī)制上存在差異，導(dǎo)致靶點(diǎn)選擇、效率、特異性和突變特征的差異[10]。其中，ZFNs 和TALENs 在早期的基因組編輯技術(shù)中占主導(dǎo)地位，但由于這2 項(xiàng)技術(shù)受效率低和適用物種范圍小等限制，未能被廣泛地應(yīng)用[11]。而新開發(fā)的CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)是基于RNA引導(dǎo)的核酸酶，與ZFNs 和TALENs 相比，具有簡單、高效和多功能性等優(yōu)勢，成為近年來最主流的基因編輯技術(shù)[12]。CRISPR 系統(tǒng)是一種復(fù)雜的適應(yīng)性免疫機(jī)制，存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，用于防御入侵的噬菌體和外源性DNA[13]，它于1987 年首次在大腸埃希菌的基因組中被發(fā)現(xiàn)[14]。根據(jù)其Cas 基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)被分為兩大類，并根據(jù)其特征基因進(jìn)一步細(xì)分為6 類：I 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)（I、III、IV 型）利用多Cas 蛋白復(fù)合物進(jìn)行靶位點(diǎn)的切割，而II 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)（II、V、VI 型）利用單個(gè)Cas 蛋白與CRISPR-RNAs（crRNAs）形成的復(fù)合物對靶位點(diǎn)進(jìn)行破壞。在CRISPR/Cas 不同類別的系統(tǒng)中，屬于II 型的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是目前技術(shù)最成熟的基因編輯系統(tǒng)[12]。

隨著技術(shù)的改進(jìn)和優(yōu)化，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已從最初的CRISPR/Cas9 發(fā)展到現(xiàn)在的多個(gè)變種及新的編輯系統(tǒng)，如CRISPR/Cas9 系統(tǒng)及變種（SpCas9、SaCas9、FnCas9、dCas9 和xCas9）、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13 系統(tǒng)等[15]。這些CRISPR/Cas 系統(tǒng)的優(yōu)化和新系統(tǒng)的開發(fā)解決了 PAM（protospacer adjacent motif）位點(diǎn)和編輯效率等限制，進(jìn)一步為植物基因組精確編輯提供了更多的選擇。然而，在植物細(xì)胞中，由于同源重組頻率偏低和DNA 供體遞送困難，CRISPR 介導(dǎo)的HDR 效率顯著受限，往往也難以實(shí)現(xiàn)高效的基因組精確編輯[16]。為提高編輯效率和精準(zhǔn)性，植物中以CRISPR/Cas 為基礎(chǔ)的基因編輯系統(tǒng)不斷被優(yōu)化與升級。堿基編輯（base editing）系統(tǒng)是新近發(fā)展的不依賴于HDR 而通過堿基精確替換的新型基因編輯技術(shù)，目前主要包括兩類：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）與腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE），可分別實(shí)現(xiàn)C-T（G-A）或A-G（T-C）的堿基替換，自開發(fā)以來已被迅速地應(yīng)用于植物中[17-18]。2019年，Anzalone 等開發(fā)了不同于堿基編輯的基因組精準(zhǔn)編輯技術(shù)，即引導(dǎo)編輯（prime editing）系統(tǒng)[19]。在此基礎(chǔ)上，國內(nèi)學(xué)者高彩霞等構(gòu)建了適于植物表達(dá)的引導(dǎo)編輯工具，并成功地在水稻和小麥中完成了DNA 精準(zhǔn)編輯[20]。除了針對Cas9 蛋白本身進(jìn)行優(yōu)化外，還有研究通過降低Cas9 在體內(nèi)活化的時(shí)間以降低其脫靶效應(yīng)，如直接向植物細(xì)胞內(nèi)遞送sgRNA 和Cas9 蛋白的核糖核苷酸蛋白（RNP）復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)基因編輯[21]。以上這些基因編輯系統(tǒng)經(jīng)過不斷地優(yōu)化與改進(jìn)，逐漸創(chuàng)制出具有高效、不依賴HDR和無外源DNA插入等優(yōu)勢的多用途編輯工具，為植物基因組編輯提供了新路徑。下面將詳細(xì)介紹CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)在柑橘中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

2 基因編輯技術(shù)在柑橘中的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 柑橘中CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)的建立和應(yīng)用

除模式植物和主要作物外，CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)已在多種木本果樹中成功運(yùn)用[22-24]。在柑橘中，Jia 等首次將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用于‘伏令夏橙’（Citrus sinensis Valencia）和‘鄧肯葡萄柚’（Citrus paradisi Macf.）中CsPDS 基因的靶向編輯，通過黃單胞桿菌亞種（Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc）輔助的農(nóng)桿菌侵染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法將Cas9 蛋白和一種合成的sgRNA 導(dǎo)入柑橘，并成功地修飾了CsPDS 基因[24]。測序結(jié)果證實(shí)了甜橙葉片中 CsPDS 基因在靶位處發(fā)生了突變，但Cas9/sgRNA 的編輯效率較低，為3.2%～3.9%，沒有檢測到脫靶效應(yīng)[24]。經(jīng)后期優(yōu)化，柑橘中建立了穩(wěn)定的CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)[25]，并在柑橘抗病育種及基因功能等研究中成功應(yīng)用（表1）。

表1 基因編輯系統(tǒng)在柑橘中的應(yīng)用

柑橘潰瘍病由柑橘黃單胞菌亞種引起，是一種非常嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，廣泛分布于全球柑橘產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重影響多數(shù)柑橘品種及重要的經(jīng)濟(jì)品種，如柑橘、柚、甜橙、檸檬和柑橘砧木等[38]。CsLOB1是一個(gè)柑橘側(cè)生器官邊界基因（citrus lateral organ boundaries 1），為植物L(fēng)BD（Lateral organ boundaries domain）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，已經(jīng)被證明是柑橘潰瘍病的關(guān)鍵感病基因[39]。柑橘潰瘍病致病菌Xcc 菌株編碼轉(zhuǎn)錄激活類（Transcription activator-like，TAL）效應(yīng)子PthA4，該效應(yīng)子可與CsLOB1 基因啟動子中的效應(yīng)子結(jié)合元件（EBE）結(jié)合并誘導(dǎo)CsLOB1 基因的表達(dá)[39]。因此，研究人員嘗試通過利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)對CsLOB1 基因進(jìn)行編輯，來提高柑橘對潰瘍病的抗性。最初研究發(fā)現(xiàn)，基于CRISPR/SpCas9 對‘鄧肯葡萄柚’中Type I CsLOB1基因EBE 元件的修改，只輕微緩解潰瘍病癥狀，并沒有獲得對潰瘍病抗性較強(qiáng)的突變株系，可能由于單個(gè)堿基的改變沒影響EBE 結(jié)合元件的功能造成的，也可能因?yàn)殡s合葡萄柚中另一個(gè)等位基因Type II CsLOB1 中的EBE 元件功能正常引起的感病[26]。因此，為保證對CsLOB1 及等位基因啟動子的編輯效率，后續(xù)有研究將5 個(gè)Cas9/CsLOB1sgRNA 載體同時(shí)成功轉(zhuǎn)入‘晚錦橙’（Citrus sinensis Osbeck），并有效地對CsLOB1 及等位基因中EBE 元件編碼序列進(jìn)行編輯（刪除或突變），編輯效率為11.5%～64.7%，其中CsLOB1 整個(gè)EBEs 編碼序列刪除的純合突變株系對潰瘍病表現(xiàn)出高度抗性[27]。此外，Jia等還在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/SpCas9 編輯CsLOB1 及等位基因的編碼區(qū)獲得的‘鄧肯葡萄柚’株系也增強(qiáng)了對潰瘍病的抗性，編輯效率為31.58%～89.36%[28]。國內(nèi)還有研究利用CRISPR/ Cas9 系統(tǒng)對CsLOB1 啟動子進(jìn)行多位點(diǎn)編輯，并獲得了較大DNA 片段刪除的突變體，基因編輯效率高達(dá)80.0%[29]。在CRISPR/SpCas9 基礎(chǔ)上優(yōu)化和新開發(fā)的基因編輯系統(tǒng)在柑橘中也已被成功應(yīng)用，如Jia 等近期還利用密碼子優(yōu)化的SpCas9（SpCas9p）系統(tǒng)來修飾純合的柚（Citrus maxima）中LOB1 基因啟動子的EBE 區(qū)域，并成功在T0代獲得等位基因純合突變的抗?jié)儾≈晗礫30]，這對縮短柑橘轉(zhuǎn)基因抗病育種的周期具有重要意義。另外，一個(gè)新開發(fā)的II類CRISPR/Cas系統(tǒng)V型核酸內(nèi)切酶CRISPR/ LbCas12a（LbCpf1）被成功用于對‘鄧肯葡萄柚’基因CsLOB1 及等位基因中EBE 元件編碼序列的編輯，并獲得了對Xcc 具有抗性的突變植株[31]。除對CsLOB1 基因進(jìn)行編輯外，近期 Wang 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對‘晚錦橙’中病原觸發(fā)免疫標(biāo)記基因CsWRKY22 進(jìn)行了敲除，獲得了68%的突變率，抗性鑒定證實(shí)CsWRKY22 基因敲除同樣降低了柑橘對潰瘍病的易感性[32]。這些研究報(bào)道表明，利用CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)對柑橘中潰瘍病感病基因等進(jìn)行編輯后，均成功提高了柑橘對潰瘍病的抗性。不僅抗病育種，CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)在柑橘基因功能研究中也有應(yīng)用。例如，Jia等利用 CRISPR/SaCas9 系統(tǒng)成功編輯枳橙中的Cs7g03360 基因，該基因?yàn)榉阎袇⑴c調(diào)控葉片發(fā)育的SlAgo 基因的同源基因，并獲得基因編輯效率為15.55%～79.67%的12 個(gè)枳橙突變株系，但可能由于這些突變株系并非純合體導(dǎo)致均未出現(xiàn)葉片變化的表型[33]。近期，Zhang 等利用CRISPR/AtYAO:hSpCas9 系統(tǒng)對‘卡里佐枳橙’（Citrus sinensis×Poncirus trifoliata）中的THORN IDENTITY 1（TI1）和TI2 基因進(jìn)行編輯，來研究二者在針刺發(fā)育成枝過程中的作用，發(fā)現(xiàn)編輯后的枳橙突變體中部分針刺可以發(fā)育轉(zhuǎn)變成枝，增加了植株分枝數(shù)量[34]。

雖然CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)在柑橘中已成功應(yīng)用，上述這些報(bào)道也表明，與其他植物相比，CRISPR/Cas 系統(tǒng)在柑橘中的編輯效率整體較低，且獲得突變植株后代的周期較長。因此，有研究人員在提高柑橘中的基因編輯效率和開發(fā)模式柑橘等方面也做了一些嘗試工作。與CaMV35S 啟動子相比，Cas9 在擬南芥YAO 啟動子驅(qū)動下的表達(dá)增加了特定位點(diǎn)的靶向突變數(shù)量[40]。鑒于此，有研究構(gòu)建了擬南芥YAO 啟動子驅(qū)動的Cas9 載體AtYAO :Cas9，對枳橙中CsPDS 基因進(jìn)行編輯，研究結(jié)果表明該系統(tǒng)穩(wěn)定高效，編輯效率為45.5%～75.0%[35]。短期熱脅迫處理被認(rèn)為是提高編輯效率的有效方法[36]。在經(jīng)過37 ℃熱激處理后，柑橘植株的突變率和擬南芥一樣也明顯增加，為45%～100%，這可能是因?yàn)殡S著溫度升高導(dǎo)致spCas9 活性升高和gRNA 表達(dá)水平增加，并引起編輯效率的提升[36]。另外，上述報(bào)道的柑橘中CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的靶向突變多以甜橙或柚為材料，但由于這2 個(gè)種類多胚和童期長的特性，這些研究發(fā)表時(shí)均還沒有獲得T1代的轉(zhuǎn)化材料，這類問題也是柑橘基因工程育種的一個(gè)巨大阻礙。近期，國內(nèi)學(xué)者首次報(bào)道了一個(gè)基于早花‘山金柑’（Fortunella hindsii）建立的實(shí)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，它大約需要15 個(gè)月即可產(chǎn)生T1代轉(zhuǎn)化材料，極大地縮短了基因工程育種的周期[37]。不過，與上述一些研究報(bào)道相比，‘山金柑’的基因編輯效率相對較低（平均約50%），這可能是由于轉(zhuǎn)化載體差異或金柑本身的自然特性造成的。‘山金柑’的基因組測序也已經(jīng)完成，單胚和童期短的特性使之可能成為柑橘分子生物學(xué)研究的一個(gè)“模式柑橘”。編輯效率的提高和“模式柑橘”的開發(fā)將進(jìn)一步擴(kuò)大CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)在柑橘中的應(yīng)用范圍。

2.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在柑橘病害傳播媒介木虱（ACP）中的應(yīng)用

柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是目前柑橘生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害，影響范圍覆蓋全球主要柑橘產(chǎn)區(qū)，以植物韌皮部汁液為食的半翅目昆蟲柑橘木虱（Asian citrus psyllid，ACP）Diaphorina citri 為主要傳播媒介[41]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR 基因編輯技術(shù)在柑橘病毒性細(xì)菌病的載體管理方面具有巨大的潛力[42]。有研究報(bào)道CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)被用來對柑橘黃龍病傳播媒介ACP 中的硫氧還蛋白基因（TRX-2）進(jìn)行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRX-2 基因被編輯突變后導(dǎo)致木虱發(fā)育延緩、生命周期縮短，而且繁殖力降低[43-44]。這些研究結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)降低依靠昆蟲傳播媒介的柑橘病害有潛力成為一種可持續(xù)和環(huán)境友好的抗病策略。

3 討論與展望

基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為植物品種改良、抗病育種和基因功能等研究的高效工具。與常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，基因編輯系統(tǒng)有助于在植物基因組中引入穩(wěn)定的遺傳位點(diǎn)修飾，并創(chuàng)造非轉(zhuǎn)基因植物[45-46]，避免了轉(zhuǎn)基因育種材料面臨的諸多限制。目前，CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)已在柑橘、蘋果、葡萄、梨、獼猴桃等木本果樹中成功應(yīng)用[22-24]。其中，CRISPR/Cas9 及其變種系統(tǒng)在柑橘的應(yīng)用主要集中在體系的建立、潰瘍病感病基因的編輯和功能基因研究等方面，成功在多個(gè)品種中建立穩(wěn)定、高效的基因編輯體系，并獲得一些抗?jié)儾〉母涕倩蚓庉嫞ㄍ蛔儯┲晗?。然而，CRISPR/Cas 系統(tǒng)在柑橘的應(yīng)用中還面臨著一些限制和挑戰(zhàn)。例如，除潛在的脫靶效應(yīng)和非靶向突變[33]，柑橘的多倍體和雜合特性對CRISPR/Cas 系統(tǒng)的應(yīng)用也極為不利。一些研究已經(jīng)證明，多倍體雜合植株的基因編輯效率通常較低，為達(dá)到敲除效果還須同時(shí)編輯多個(gè)等位基因[29,47]，增加了獲得純合突變株系的難度。基因編輯系統(tǒng)在柑橘中應(yīng)用面臨的另一個(gè)重要挑戰(zhàn)是缺乏適用不同品種的高效轉(zhuǎn)化方法和傳遞技術(shù)。遺傳轉(zhuǎn)化方法往往局限于特定的組織和培養(yǎng)類型，并不能應(yīng)用于所有柑橘品種，不同品種間轉(zhuǎn)化和組織再生效率有很大差異。目前，基因編輯系統(tǒng)的元件主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的傳遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入柑橘外植體的細(xì)胞，并通過耗時(shí)的組織培養(yǎng)方法獲得植株的再生后代。

近年來，隨著CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)的改進(jìn)和創(chuàng)新，一些更高效和精準(zhǔn)的基因編輯系統(tǒng)不斷出現(xiàn)。因此，加速將在CRISPR/Cas9 基礎(chǔ)上開發(fā)的新的變種系統(tǒng)、堿基編輯和引導(dǎo)編輯等系統(tǒng)在柑橘中的應(yīng)用進(jìn)程，以此來解決編輯效率和潛在的脫靶效應(yīng)等相關(guān)問題。而且，從目前研究面臨的限制來看，優(yōu)化現(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化方法和開發(fā)更高效的傳遞系統(tǒng)是進(jìn)一步促使CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)在柑橘育種中廣泛應(yīng)用亟待解決的問題。除農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法外，Cas9/sgRNA 核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式直接導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，既提高了編輯效率，又可以很好地解決外源DNA 的插入問題，但該技術(shù)受原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化和再生體系的限制[48-50]。所以，開發(fā)不同柑橘品種的單細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法和再生體系，將有助于加快基因編輯介導(dǎo)的育種進(jìn)程。隨著技術(shù)的發(fā)展，新興的納米載體逐漸成為CRISPR/Cas 系統(tǒng)元件的潛力遞送工具。已經(jīng)有報(bào)道利用納米材料作為載體，成功將外源DNA 和CRISPR/Cas 元件導(dǎo)入植物花粉或原生質(zhì)體[51-52]，這種傳遞方式不僅避開了轉(zhuǎn)化和組培過程，還可能解決品種特異性對植株再生的限制。近期還有研究報(bào)道了使用RNA 病毒載體表達(dá)可移動的sgRNA 和從頭誘導(dǎo)分生組織的方法，獲得基因編輯植株的后代[53]。納米材料傳遞載體和分生組織的誘導(dǎo)編輯等這些不需要組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法，將成為植物基因編輯未來發(fā)展的一種趨勢，但其是否同樣適用于柑橘，也有待研究證實(shí)。相信隨著柑橘重要性狀調(diào)控基因和病害相關(guān)等基因的挖掘，CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)勢必將成為柑橘基因工程育種等研究廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要工具。