楊 鵬，趙美蘭，楊宇慎，趙雪峰

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌死亡相關(guān)最主要的原因，其主要治療方案為輔助化療聯(lián)合靶向治療。然而，一方面只有40%～60%的患者對(duì)這些抗癌藥物有反應(yīng)，另一方面即使對(duì)抗癌藥物有反應(yīng)的患者也不可避免地進(jìn)一步惡化，故其整體中位生存期通常不超過2～2.5 年[1]。導(dǎo)致抗癌藥物療效低下的最主要原因是抗癌藥物的耐藥性。因此，發(fā)現(xiàn)一種具有抗腫瘤作用、且可有效改善傳統(tǒng)抗癌藥物耐藥性的新藥物迫在眉睫。

冬凌草甲素（oridonin）是冬凌草的葉子中提取出的一種貝殼杉烯二萜類化合物，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗菌及較好的抗腫瘤活性作用[2-4]。近期發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對(duì)前列腺和乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、急性白血病、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及人類黑色素瘤等多種惡性腫瘤均有抑制作用[5-9]，但關(guān)于是否能抑制轉(zhuǎn)移研究卻寥寥無幾。雖然Zheng 等[10]證實(shí)冬凌草甲素可通過誘導(dǎo)壞死性凋亡而增強(qiáng)5-FU 的細(xì)胞毒性，Xu 等[11]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素通過凋亡基因而增強(qiáng)香菇多糖對(duì)SMMC-7721人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的抗癌效果，但對(duì)冬凌草甲素聯(lián)合奧沙利鉑治療結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移還未有報(bào)道。因此，本課題以裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立方式，研究冬凌草甲素與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移抑制。

1 材料和方法

1.1 材料 冬凌草甲素購自普思生物科技有限公司，與二甲亞砜配制成0.1 mol/L 儲(chǔ)存液備用；奧沙利鉑購自江蘇恒瑞股份有限公司；HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞株由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代捐助；BALb/c 品系裸鼠24 只，6 周齡雌性，體質(zhì)量18～20 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購買。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞株接種于100 mm培養(yǎng)皿中，并在37 ℃、5% CO2，含10%牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至80%～90%融合后，利用0.25%胰酶消化液消化，1 200 r/min 離心3 min，丟棄上清液，加無血清RPMI1640 培養(yǎng)液洗細(xì)胞2 次，顯微鏡下計(jì)數(shù)。制備成細(xì)胞濃度為5×107/mL 的混懸液，待行動(dòng)物模型中備用。

1.2.2 動(dòng)物模型設(shè)計(jì) 制模前1 周為穩(wěn)定期，減少一切刺激；1 周后，利用HT29 人結(jié)腸癌細(xì)胞株建立穩(wěn)定型裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型[12]24 只；1 周后，按尾靜脈注入成分不同，隨機(jī)分成6 只冬凌草甲素單一應(yīng)用組[100 mg/（kg·d），OD 組]、6 只奧沙利鉑單一應(yīng)用組[5 mg/（kg·d），Oxa 組]、6 只冬凌草甲素與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用組[OD-100 mg/（kg·d）plus Oxa-5 mg/（kg·d），OD 加Oxa 組]及6 只對(duì)照組（RPMI 1640 100 μL，Control 組）；分組制模3 周后處死，并觀察各組情況。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo) 每天常規(guī)觀察記錄裸鼠狀態(tài)，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型4 周或分組制模（藥物干預(yù)模型）3周后，各組裸鼠進(jìn)行脫頸處死。首先解剖觀察肝質(zhì)量、血性腹水、膽汁淤積及肝轉(zhuǎn)移評(píng)分[13]，其次觀察局部浸潤發(fā)生率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及腹膜種植轉(zhuǎn)移率，同時(shí)觀察胸腔內(nèi)、顱內(nèi)有無轉(zhuǎn)移情況。所有肉眼可疑部位照相并取材，行病理學(xué)檢查。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，2 組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，2 組計(jì)數(shù)資料比較均采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型成功率為100%（24/24）。與Control 組相比，OD 組、Oxa 組及OD加Oxa 組均可顯著降低或減少肝質(zhì)量、血性腹水、膽汁淤積及肝轉(zhuǎn)移評(píng)分，而OD 加Oxa 組更能顯著抑制肝轉(zhuǎn)移形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Control組局部浸潤發(fā)生率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及腹膜種植轉(zhuǎn)移率有增高趨勢(shì)，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 分析各組裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型（n=6）

3 討論

奧沙利鉑是臨床治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移最常用的化療藥物，可顯著改善患者的總體生存期[14-15]。然而，奧沙利鉑耐藥卻是導(dǎo)致結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后不良以及化療失敗的主要因素。奧沙利鉑耐藥主要與增加藥物外流、改善基本切除修復(fù)功能以及增強(qiáng)谷胱甘肽和金屬蛋白酶的脫毒能力等幾個(gè)方面有關(guān)[16-17]。因此，可阻斷藥物外流、恢復(fù)癌細(xì)胞凋亡程序和損壞DNA修復(fù)活動(dòng)的表皮生長因子絡(luò)氨酸激酶抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗被成功用于治療對(duì)奧沙利鉑耐藥的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，且西妥昔單抗已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療進(jìn)展期結(jié)腸癌[18]。但癌細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)往往涉及多個(gè)不同機(jī)制，而且這些耐藥機(jī)制還會(huì)隨著疾病和治療的進(jìn)展不斷變化，所以僅作用于單一耐藥機(jī)制的傳統(tǒng)靶向藥物不足以完全逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的耐藥性[19]。此外，西妥昔單抗雖已被批準(zhǔn)用于臨床，但僅對(duì)野生型KRAS 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者有效，且長期使用同樣會(huì)出現(xiàn)耐藥，故而臨床應(yīng)用價(jià)值十分受限。因此，研發(fā)一種具有抗腫瘤活性、可作用于多個(gè)耐藥機(jī)制以增強(qiáng)奧沙利鉑敏感性的新型藥物對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療將具有十分重要的臨床價(jià)值和意義。

與傳統(tǒng)抗癌藥物相比較，冬凌草甲素具有以下幾大優(yōu)勢(shì)：1）冬凌草甲素可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞不造成任何負(fù)面影響。因此，冬凌草甲素在不損傷骨髓、肝及腎等人體重要臟器的同時(shí)，能有效的抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞[20]。2）冬凌草甲素可作用于多個(gè)信號(hào)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。Liu 等[21]揭示冬凌草甲素可通過上調(diào)BMP-7 而激活p38MAPK信號(hào)通路，從而抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；Zheng 等[10]報(bào)道冬凌草甲素可通過激活JNK、P38 和ERK 而誘導(dǎo)腎癌786-O 細(xì)胞壞死性凋亡，因而增強(qiáng)5-FU 的細(xì)胞毒性作用；而且近期熊朝剛等[22]還證實(shí)冬凌草甲素可通過上調(diào)RIP1 和RIP3而誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，從而增強(qiáng)5-FU 對(duì)結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)提示冬凌草甲素可作用于不同的信號(hào)通路來恢復(fù)癌細(xì)胞凋亡程序從而增強(qiáng)其對(duì)氟尿嘧啶的敏感性。因此，筆者推斷冬凌草甲素或許也能作用于多種不同的耐藥機(jī)制或信號(hào)通路來改善結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性；3）龍景培等[23]已經(jīng)證實(shí)冬凌草甲素可調(diào)結(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來上調(diào)細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 的表達(dá)、下調(diào)Vimentin 的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、EMT 過程以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究首次發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素或奧沙利鉑單藥皆可抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，且二者聯(lián)合藥物干預(yù)可大幅度增加轉(zhuǎn)移抑制效果。該結(jié)果證實(shí)冬凌草甲素不僅可抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，亦能增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，改善癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性。

盡管冬凌草甲素在惡性腫瘤治療方面優(yōu)勢(shì)顯著，但效能低且半衰期短的藥學(xué)特性極大的限制了該藥的臨床應(yīng)用。因此，許多策略正被研發(fā)來解決這一缺陷，結(jié)構(gòu)修飾就是其中一種。近年來，許多學(xué)者在這方面取得了令人鼓舞的進(jìn)展。Wang 等[24]研發(fā)的冬凌草甲素衍生物Geridonin 可通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS 而誘導(dǎo)胃癌MGC803 細(xì)胞凋亡，該衍生物的毒性作用明顯強(qiáng)于冬凌草甲素。近期Shen 等[25]合成的另一種冬凌草甲素衍生物compound C7 能顯著抑制HCT116 癌細(xì)胞的增殖，且其臨床效能是冬凌草甲素的43 倍。本實(shí)驗(yàn)組結(jié)合現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及現(xiàn)有的相關(guān)理論，為了更好的將冬凌草甲素的優(yōu)勢(shì)運(yùn)用于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療，一方面會(huì)繼續(xù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入闡明冬凌草甲素與奧沙利鉑的協(xié)同作用機(jī)理及分子機(jī)制，另一方面將著手開展冬凌草甲素衍生物的相關(guān)研究。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，若能于以上兩個(gè)方面取得重大突破，將會(huì)極大的推動(dòng)冬凌草甲素與奧沙利鉑聯(lián)合治療在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移治療中的應(yīng)用。

綜上所述，本研究首次通過構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，在in vivo 平臺(tái)上闡述了冬凌草甲素及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的抑制效果。冬凌草甲素與奧沙利鉑聯(lián)合藥物干預(yù)可大幅度增加轉(zhuǎn)移抑制效果，至于具體的轉(zhuǎn)移機(jī)制有必要進(jìn)行臨床試驗(yàn)的量化指標(biāo)來判定轉(zhuǎn)移抑制效果。