周鏑，田野，楊雪鷹

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸外科，沈陽(yáng) 110032）

肺癌是高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，自2018年以來(lái)，全球每年約有177萬(wàn)人死于肺癌［1］。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的80%。在過(guò)去的幾十年里，NSCLC的診斷和治療水平得到了較大的提升，然而，只有約16%的患者能夠在早期得到診斷和治療，肺癌的5年生存率仍然低于20%［2］。因此，尋找更有價(jià)值的生物標(biāo)志物和探索新的治療靶點(diǎn)是NSCLC治療中亟待解決的問(wèn)題。

微RNA（microRNAs，miRNAs）是一種小的非編碼RNA分子，通過(guò)與相應(yīng)的靶點(diǎn)信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’非翻譯性區(qū)域（3’untranslation region，3’UTR）直接相互作用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)［3］，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究［3］表明，miRNAs的錯(cuò)誤表達(dá)與多種人類癌癥相關(guān)，有學(xué)者將其定義為腫瘤抑制因子或抑癌基因。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a/b/c、miR-135a、miR-203在NSCLC中均出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)下調(diào)［4］，且有證據(jù)表明miR-203參與了多種腫瘤的發(fā)生［5-6］。但其在NSCLC發(fā)生及進(jìn)展中的作用和機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-203在人NSCLC組織中的表達(dá)情況，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究miR-203在NSCLC中的作用，以期為NSCLC的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選取2018年至2019年于我科接受手術(shù)治療的NSCLC患者20例，術(shù)中留取新鮮NSCLC組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。所有患者均簽署知情同意書(shū)。本研究符合赫爾辛基宣言，并獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人NSCLC細(xì)胞系H1650和LTEP-a-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d傳代1次。將細(xì)胞分為對(duì)照組和miR-203過(guò)表達(dá)組2組。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)：用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA。按照PrimeScript RT試劑試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行互補(bǔ)DNA合成。采用正向引物5’-TCAAACTT CACAGGTTGCC-3’和反向引物5’-GATCATGTTCCA CCACAATG-3’檢測(cè)ABCE1轉(zhuǎn)錄水平。β-actin作為內(nèi)參，正向引物序列為5’-AGACCTGTACGCCAACAC AG-3’，反向引物序列為5’-CGGACTCGTCATACTC CTGC-3’。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用TaqMan miRNA分析（美國(guó)Applied Biosystems公司）試劑盒檢測(cè)成熟miR-203的表達(dá)水平，并使用U6小核RNA作為內(nèi)參。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LTEP-a-2細(xì)胞按照3×105/孔接種于6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。用2 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理4 h。在200 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中加入2 μg DNA和2 μL PLUS試劑，室溫孵育10 min，然后加入200 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基加入6 μL LTX試劑，配制成轉(zhuǎn)染工作液，室溫孵育30 min。棄掉孔中培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染工作液并將6孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。4 h后加入200 μL胎牛血清。轉(zhuǎn)染24～48 h后，進(jìn)入功能試驗(yàn)。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)：取出6孔板，用1 mL移液器吸頭在孔中垂直作一劃痕。用PBS清洗細(xì)胞3次，隨后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，拍照。將6孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出拍照。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞處理24 h后，移去培養(yǎng)基，更換成無(wú)血清培養(yǎng)基，常規(guī)條件下培養(yǎng)饑餓24 h。收集細(xì)胞到離心管中，1 000 r/min離心5 min，加入4 ℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。加入1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為（1～5）×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液至于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC 混勻后于室溫避光孵育5 min，加入10 μL PI染液，并加入400 μL PBS后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。采用Flowjo軟件對(duì)流式結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203及ABCE1在NSCLC及癌旁組織的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)PCR對(duì)20例NSCLC及癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，NSCLC組織中miR-203平均表達(dá)水平（0.369±0.338）與癌旁組織（0.575±0.450）相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019）。而NSCLC組織中的ABCE1表達(dá)水平（1.243±0.716），較癌旁組織（0.739±0.316）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 6）。

2.2 miR-203在體外負(fù)性調(diào)節(jié)ABCE1的基因表達(dá)

由于miR-203在非小細(xì)胞肺癌的組織和細(xì)胞系中表達(dá)較低，miR-203水平相對(duì)較低的肺腺癌細(xì)胞系H1650、LTEP-a-2被用來(lái)評(píng)估m(xù)iR-203誘導(dǎo)的效果。采用miR-203 mimics模擬表達(dá)載體誘導(dǎo)miR-203表達(dá)，實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，miR-203在H1650、LTEP-a-2中表達(dá)分別達(dá)到1.954±0.099和5.631±0.282，較對(duì)照組（1.021±0.046和0.099±0.039）均有升高，提示過(guò)表達(dá)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-203在H1650和LTEP-a-2細(xì)胞中使ABCE1mRNA水平分別達(dá)到0.449±0.049和0.353±0.018，較對(duì)照組（1.009±0.156和1.005±0.060）降低50%以上，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），提示miR-203能夠抑制ABCE1表達(dá)。

2.3 miR-203在體外抑制NSCLC的遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-203過(guò)表達(dá)對(duì)H1650和LTEP-a-2細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，miR-203 mimics轉(zhuǎn)染的H1650和LTEP-a-2細(xì)胞遷移區(qū)域分別為0.354±0.035和0.456±0.016，與對(duì)照組（0.585±0.021、0.590±0.013）相比，轉(zhuǎn)染miR-203的細(xì)胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 miR-203過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Fig.1 Effects of miR-203 overexpression on cell migration

2.4 miR-203過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)體外NSCLC細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-203 mimics轉(zhuǎn)染的H1650和LTEP-a-2細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞比例分別達(dá)到31.307%±1.420%和35.250%±0.512%，明顯高于對(duì)照組（13.068%±1.364%和19.313%±0.688%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），提示miR-203過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖2。

圖2 miR-203過(guò)表達(dá)對(duì)H1650和LTEP-a-2細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of miR-203 overexpression on apoptosis of H1650 and LTEP-a-2 cells

3 討論

NSCLC的生存和預(yù)后相對(duì)較差，部分原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及對(duì)化療、放療和靶向治療的耐藥［7］。因此，闡明NSCLC的分子發(fā)病機(jī)制，對(duì)制定有效的干預(yù)策略至關(guān)重要。單個(gè)miRNA序列能夠調(diào)控眾多靶基因［8］，miRNA通過(guò)調(diào)控不同的靶點(diǎn)來(lái)驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，如miR-200、miR-34a在乳腺癌和腦膜瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9-10］。本研究結(jié)果顯示，miR-203在NSCLC細(xì)胞和組織表達(dá)下調(diào)，作為一個(gè)腫瘤抑制microRNA，通過(guò)抑制ABCE1途徑的多個(gè)關(guān)鍵組件，抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移。

miR-203是本課題組前期研究中獨(dú)立篩選出的與肺癌密切相關(guān)的基因，并被證實(shí)具有確切的影響肺癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等行為的功能。本文系統(tǒng)研究miR-203對(duì)ABCE1的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步探討肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制，不僅有助于解決肺癌基礎(chǔ)理論的相關(guān)問(wèn)題，還有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點(diǎn)。已有研究［11］表明，miR-203通過(guò)抑制GATA6的表達(dá)來(lái)降低人類結(jié)腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性；在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中，miR-203通過(guò)調(diào)節(jié)ZEB2參與了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通路的激活［12］；miR-203在食管癌細(xì)胞中是一種腫瘤抑制因子，其表達(dá)水平有可能被用作食管癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)［13］。以上均提示miR-203的功能依賴于腫瘤細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，miR-203在NSCLC細(xì)胞系和腫瘤組織中的表達(dá)明顯降低。這一數(shù)據(jù)提示miR-203在調(diào)控多種信號(hào)通路方面發(fā)揮著核心作用，對(duì)于肺癌藥物的開(kāi)發(fā)具有潛在意義。

ABCE1是ATP結(jié)合盒超家族的成員之一，但是缺乏該家族其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所共有的跨膜區(qū)域，因此不參與任何跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。近年來(lái)，隨著對(duì)ABCE1基因深入的研究，有證據(jù)表明該基因可能與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)［14］。最新的報(bào)道［15］顯示，ABCE1對(duì)于肺癌化療的敏感性有重要的作用。前期工作中本課題組應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性敲除ABCE1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)其抑制了肺腺癌細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，除了負(fù)性調(diào)節(jié)2-5A/ RNase L通路以及參與蛋白翻譯過(guò)程［16］，ABCE1基因的機(jī)制研究不多，其在腫瘤內(nèi)乃至肺癌內(nèi)的作用機(jī)制和細(xì)胞通路尚未明確。

綜上，本研究首次篩選出NSCLC組織內(nèi)能夠有效調(diào)節(jié)ABCE1基因的 miR-203，并證實(shí)miR-203在肺癌內(nèi)表達(dá)的減少降低了對(duì)ABCE1基因的負(fù)性調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)了肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制了凋亡。miR-203及其調(diào)節(jié)的ABCE1基因很有可能作為新的突破口，為肺癌的診治提供新的思路。