呂洪濤，李俊，孫錫同

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.神經(jīng)外科；2.急診科，遼寧 大連 116011）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具侵襲性和致死性的腫瘤，以高復(fù)發(fā)率和高死亡率為顯著特征［1］。盡管許多學(xué)者付出了巨大努力，但在膠質(zhì)瘤治療方面幾乎沒有取得進(jìn)展［2］。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是惡性程度最高的顱內(nèi)惡性腫瘤，屬于Ⅳ級惡性膠質(zhì)瘤，是僅次于腦膜瘤的第二常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，同時也是侵襲性最高的顱內(nèi)惡性腫瘤［3］。在無任何治療情況下，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中位生存時間僅為3個月［4］。因此，研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在生物標(biāo)志物并為疾病的診斷和治療提供新的見解至關(guān)重要。過去的十年中，表觀遺傳修飾尤其是DNA甲基化，已成為癌癥研究的重點。DNA甲基化的變化可能會影響基因表達(dá)和反饋機(jī)制，并產(chǎn)生各種促進(jìn)或抑制腫瘤的作用［5］。目前，研究已經(jīng)報道多種甲基化基因生物標(biāo)志物，如MGMT啟動子甲基化是膠質(zhì)瘤預(yù)后的主要生物標(biāo)志物［6］，并可預(yù)測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者對替莫唑胺治療的反應(yīng)性［7］。本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的相關(guān)數(shù)據(jù)，對復(fù)發(fā)與無復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織的基因甲基化差異程度進(jìn)行分析，篩選出具有差異甲基化的基因，并進(jìn)一步探討該基因能否成為新的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后標(biāo)志物，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U373，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.1.2 主要試劑：高糖DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；TRIzol試劑、Lipofecamine 2000、LYSMD1cDNA和陰性對照（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix（寶生物工程有限公司）；MTT試劑（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)和傳代。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)LYSMD1過表達(dá)。

1.2.2 Western blotting：將U373細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染LYSMD1cDNA的LYSMD1過表達(dá)組和不加任何處理因素的陰性對照組。2組細(xì)胞均在培養(yǎng)48 h后，裂解并提取蛋白，進(jìn)行Western blotting，檢測目的蛋白的表達(dá)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖：將U373細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染LYSMD1cDNA的LYSMD1過表達(dá)組和不加任何處理因素的陰性對照組。細(xì)胞鋪96孔板，5×103/孔，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，培養(yǎng)前加入MTT（5 mg/mL），隨后溶于DMSO（100 μL/孔），酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值（490 nm波長），實驗重復(fù)3次。

1.3 生物信息學(xué)分析

通 過TCGA（http：//cancergenome.nih.gov）數(shù) 據(jù)庫下載膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，包含160例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本。排除2例無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）為0的患者樣本，共158例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本納入分析。根據(jù)有無復(fù)發(fā)，將158例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者分為復(fù)發(fā)組（n=93）和無復(fù)發(fā)組（n=65）。通過UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/datapages）數(shù)據(jù)庫下載膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的DNA甲基化數(shù)據(jù)，共158例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本納入DNA甲基化分析。

每個檢測的CpG位點的甲基化水平均由β值表示，β值是一組0～1范圍的連續(xù)變量，0代表完全未甲基化，1代表完全甲基化，β值分布符合非對稱雙峰分布。RNA-seq原始數(shù)據(jù)集用R語言“edgeR”軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化。DNA甲基化數(shù)據(jù)用于差異甲基化分析。比較復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組，鑒定出差異甲基化的CpG位點。錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

將差異基因投入到單因素、多因素Cox回歸分析中，并將臨床病理參數(shù)（年齡、種族、性別、腫瘤狀態(tài)）作為協(xié)變量進(jìn)行分析，篩選出與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者RFS相關(guān)的獨立預(yù)后基因。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。生存分析采用Kaplan-Meier法并用log-rank進(jìn)行檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初步篩選出23個差異甲基化的CpG位點

從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中下載膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的DNA甲基化數(shù)據(jù)，共獲得485 578個CpG位點。通過對復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組進(jìn)行比較，篩選出23個差異甲基化的CpG位點。與無復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)組中9個CpG位點甲基化程度顯著下調(diào)，14個CpG位點甲基化程度顯著上調(diào)。見圖1、表1。

表1 復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組中CpG位點的差異甲基化情況Tab.1 Differential methylation of CpG sites in the recurrent and non-recurrent glioblastoma groups

圖1 初步篩選出23個差異甲基化的CpG位點Fig.1 Twenty-three CpG sites with differential methylation were preliminarily screened

2.2 差異甲基化的LYSMD1基因表達(dá)水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后相關(guān)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，23個差異甲基化的CpG位點對應(yīng)20個基因（表2）。分別比較這20個基因在復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組的差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在這20個基因中，僅LYSMD1基因的表達(dá)在復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.024 9，圖2A、表2）。與復(fù)發(fā)組相比，無復(fù)發(fā)組LYSMD1基因顯著高表達(dá)，這與前面分析的復(fù)發(fā)組LYSMD1基因的CpG位點甲基化程度顯著上調(diào)這一結(jié)果相符。見表1、表2。

表2 復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組中差異甲基化基因的表達(dá)情況Tab.2 Expression of differentially methylated genes in the recurrent and non-recurrent glioblastoma groups

利用Kaplan-Meier生存曲線，進(jìn)一步分析LYSMD1基因的表達(dá)水平和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者RFS之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，LYSMD1基因的表達(dá)水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者RFS顯著相關(guān)，LYSMD1高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者較長RFS相關(guān)（P=0.031 3，圖2B）。將LYSMD1基因和臨床病理參數(shù)（年齡、種族、性別、腫瘤狀態(tài)）投入到單因素Cox回歸分析中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LYSMD1基 因（HR=0.627，95%CI：0.413～0.950，P=0.028）和腫瘤狀態(tài)（HR=3.467，95%CI：1.735～6.924，P＜ 0.000 1）與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者RFS顯著相關(guān)（圖2C）。多因素Cox回歸分析結(jié)果提示，LYSMD1基因（HR=0.583，95%CI：0.384～0.886，P=0.012）和腫瘤狀態(tài)（HR=3.658，95%CI：1.827～7.319，P＜ 0.000 1）具有獨立預(yù)測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者RFS的潛在作用，LYSMD1低表達(dá)提示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險（圖2D）。

2.3 誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LYSMD1表達(dá)后細(xì)胞增殖減慢

上述結(jié)果提示LYSMD1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可能發(fā)揮抑癌基因作用，進(jìn)一步通過細(xì)胞實驗進(jìn)行驗證，將LYSMD1cDNA轉(zhuǎn)染至U373細(xì)胞，通過Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染LYSMD1cDNA后，LYSMD1表達(dá)明顯降低（圖3），即有效誘導(dǎo)細(xì)胞中LYSMD1高表達(dá)。接下來通過MTT法檢測細(xì)胞增殖水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LYSMD1基因過表達(dá)可使U373細(xì)胞增殖活性減弱（圖4），提示LYSMD1可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖活性發(fā)揮抑癌作用。

圖4 LYSMD1過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of LYSMD1 overexpression on the proliferation of glioma cells

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種預(yù)后不良的腦腫瘤，盡管目前臨床存在多種膠質(zhì)瘤治療方法，但其復(fù)發(fā)率仍居高不下，復(fù)發(fā)率高是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良的重要原因［1］。研究［8］證明，DNA甲基化通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響患者生存。癌基因或抗癌基因甲基化程度過高或過低對不同類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有重大影響［9-11］。目前，已有研究［12-16］報道了多種甲基化基因生物標(biāo)志物。

本研究根據(jù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者有無復(fù)發(fā)，將患者分為復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組，初步篩選出23個差異甲基化的CpG位點，對應(yīng)20個基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在這20個基因中，僅LYSMD1基因的表達(dá)在復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組間存在統(tǒng)計學(xué)差異。與復(fù)發(fā)組相比，無復(fù)發(fā)組LYSMD1基因顯著高表達(dá)，這與復(fù)發(fā)組LYSMD1基因的CpG位點甲基化程度顯著上調(diào)這一結(jié)果一致。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果提示，LYSMD1高表達(dá)患者的RFS較LYSMD1低表達(dá)患者明顯延長。單因素、多因素Cox回歸分析結(jié)果提示，LYSMD1和腫瘤狀態(tài)是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者RFS的獨立預(yù)后因素。

到目前為止，關(guān)于LYSMD1基因在腫瘤中的作用未見報道，本研究首次提出其可能作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)志物，影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。LYSMD1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制如何，將在今后的研究中深入開展。

綜上所述，具有差異甲基化的LYSMD1基因與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后相關(guān)，可能成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后分析的新指標(biāo)，為今后對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)研究和臨床輔助治療提供參考。但本研究僅基于生物信息學(xué)分析，未來需要更大樣本的同類數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，同時開展相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究，以確認(rèn)這些指標(biāo)的穩(wěn)定性和實用性。