趙恒伍，王文娟，陳勝武

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第三醫(yī)院骨科，遼寧 錦州 121001；2.附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，遼寧 錦州 121001）

目前，全球人口老齡化日益加重，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也隨之升高。骨質(zhì)疏松極易導(dǎo)致一系列不良后果和并發(fā)癥，甚至出現(xiàn)致殘、致死等嚴(yán)重后果［1-2］。鐵作為機(jī)體必需的元素，在人體內(nèi)發(fā)揮非常重要的生物學(xué)功能，包括參與DNA修復(fù)、維持細(xì)胞生長、細(xì)胞分裂、呼吸作用等生命代謝活動，但是鐵過多也會對人體的細(xì)胞和組織產(chǎn)生危害。有臨床研究［3］報道，骨質(zhì)疏松癥見于多種與鐵超載相關(guān)疾病的患者中。實驗研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，鐵超載可導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能減弱，干擾干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致體內(nèi)骨代謝進(jìn)一步失衡，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。但是，這一病理過程以及鐵的具體作用和相關(guān)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）-p38信號通路是一個與鐵離子密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，鐵離子的濃度直接影響該信號通路的表達(dá)。鐵死亡是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性死亡途徑，是一種全新的細(xì)胞死亡模式，在其發(fā)生過程中，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物大量累積，攻擊生物大分子，使細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡現(xiàn)象。目前已有研究報道，它與多種疾病有關(guān)，如癌癥、腎臟疾病、腦損傷性疾病等。這種鐵依賴性細(xì)胞死亡形式在生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)方面均不同于其他細(xì)胞死亡方式［6］，這種現(xiàn)象具有明顯的鐵離子依賴性，但其在成骨細(xì)胞中的作用和相關(guān)機(jī)制未見報道。本研究旨在探討鐵超載條件下成骨細(xì)胞功能的變化，并探討ASK1-p38通路介導(dǎo)的鐵死亡機(jī)制在這個過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人成骨細(xì)胞系hFOB1.19購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，使用DMEM-F12培養(yǎng)基（美國Sigma-Aldrich公司）加入10%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入1%青鏈霉素（美國Sigma-Aldrich公司）。細(xì)胞在33.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d換1次液。枸櫞酸鐵銨（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC）購于美國Sigma-Aldrich公司；人成骨樣細(xì)胞礦化誘導(dǎo)試劑盒購于中國Cyagen公司；成骨細(xì)胞茜素紅礦化染色試劑盒購于中國碧云天公司?？构潜Ｗo(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、抗ASK1、抗p38抗體及其對應(yīng)磷酸化抗體均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建培養(yǎng)體系及不同濃度FAC的干預(yù)：人hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，置于34℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶常規(guī)消化傳代［7］。為了探究高鐵環(huán)境對成骨細(xì)胞的影響，分別設(shè)置空白對照組（0 μmol/L FAC）、100 μmol/L FAC組、200 μmol/L FAC組。FAC處理24 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 茜素紅染色測定：hFOB1.19細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)。各組細(xì)胞經(jīng)處理后，應(yīng)用Cyagen礦化誘導(dǎo)試劑盒進(jìn)行誘導(dǎo)礦化操作，礦化誘導(dǎo)液內(nèi)含礦化專用培養(yǎng)基及血清、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松。具體配置方法和各組分濃度按說明書操作，每3 d換液1次，共誘導(dǎo)2～4周。細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定30 min，根據(jù)礦化染色試劑盒（中國碧云天公司）說明書進(jìn)行染色，然后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，并且計數(shù)10個視野的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.2.3 Western blotting檢測：將收集的細(xì)胞在4 ℃下加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制的裂解緩沖液裂解30 min，然后4 ℃、12 000g離心30 min，保留上清液，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。總蛋白提取后，通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白（50 μg蛋白質(zhì)），60 V下將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用含有5%脫脂乳的封閉緩沖液封閉聚偏二氟乙烯膜2 h。4 ℃下以1∶100～1∶1 000稀釋的一抗孵育過夜，隨后將膜與二抗（抗小鼠、抗兔或抗羊）一起溫育。IgG以1∶6 000或1∶10 000稀釋并與辣根過氧化物酶耦聯(lián)，室溫下孵育2 h。用EC3成像系統(tǒng)（美國UVP公司）顯現(xiàn)條帶，應(yīng)用ImageJ軟件測量條帶的光密度與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。

1.2.4 透射電鏡檢測：各組細(xì)胞培養(yǎng)后，使用細(xì)胞刮刀小心刮下細(xì)胞，800 r/min離心，棄去上清，用2.5%戊二醛固定細(xì)胞團(tuán)塊，乙醇梯度脫水后進(jìn)行滲透，包埋，切片。將切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于透射電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FAC降低成骨細(xì)胞的成骨功能

為了探究FAC對成骨細(xì)胞成骨功能的影響，應(yīng)用Western blotting檢測成骨細(xì)胞中OPG的表達(dá)，并應(yīng)用鈣結(jié)節(jié)染色測定成骨細(xì)胞的礦化能力。結(jié)果顯示，F(xiàn)AC抑制成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，F(xiàn)AC濃度越高，OPG表達(dá)越少。FAC抑制成骨細(xì)胞的礦化，F(xiàn)AC濃度越高，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量越少。結(jié)果表明，F(xiàn)AC抑制了成骨細(xì)胞的成骨功能。見圖1。

圖1 FAC抑制成骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞成骨功能Fig.1 FAC inhibits the differentiation and osteogenic function of osteoblasts

2.2 FAC導(dǎo)致成骨細(xì)胞的鐵死亡現(xiàn)象增強(qiáng)

為了探討FAC對成骨細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象的影響，檢測FAC干預(yù)下成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，200 μmol/L FAC干預(yù)后成骨細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)發(fā)生明顯改變，線粒體雙層膜密度增加，線粒體內(nèi)嵴減少或消失，密度降低，符合鐵死亡形態(tài)學(xué)變化特征。結(jié)果表明，F(xiàn)AC可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的鐵死亡現(xiàn)象。見圖2。

圖2 FAC干預(yù)增強(qiáng)成骨細(xì)胞內(nèi)的鐵死亡現(xiàn)象 ×2 500Fig.2 FAC enhances ferroptosis in osteoblasts ×2 500

2.3 FAC通過激活A(yù)SK1/p38通路調(diào)控鐵死亡發(fā)生

為了探究FAC影響成骨細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象的具體分子機(jī)制，檢測ASK1和p38通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在100 μmol/L和200 μmol/L FAC干預(yù)下，ASK1和p38的表達(dá)均升高，且與成骨細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象一致。結(jié)果表明，F(xiàn)AC可以通過調(diào)控ASK1-p38信號通路調(diào)控成骨細(xì)胞鐵死亡。見圖3。

圖3 FAC調(diào)控ASK1和p38的表達(dá)Fig.3 FAC regulates the expression of ASK1 and p38

3 討論

骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響人類的健康，本課題組的前期研究［7］發(fā)現(xiàn)，鐵超載可以刺激成骨細(xì)胞的自噬與凋亡，其具體機(jī)制可能與二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1有關(guān)。鐵作為體內(nèi)最常見的微量元素之一，對維持機(jī)體生命活動具有不可代替的作用。研究證實，機(jī)體內(nèi)鐵離子處于動態(tài)平衡中，不斷被吸收、利用、儲存、循環(huán)，被稱為鐵穩(wěn)態(tài)。鐵穩(wěn)態(tài)的存在，對細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)主要由多種鐵相關(guān)蛋白調(diào)控，包括細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白、二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和轉(zhuǎn)鐵蛋白等。既往有研究［8］報道，鐵超載可導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)流失，并認(rèn)為其機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。還有研究［9］發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病性骨質(zhì)疏松的骨組織中成骨細(xì)胞出現(xiàn)鐵超載，引起細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終影響成骨細(xì)胞的成骨功能，說明2型糖尿病骨質(zhì)疏松骨組織中存在鐵穩(wěn)態(tài)的失調(diào)。以上研究均表明，骨質(zhì)疏松與鐵離子的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。

2012年研究報道了一種新的程序性死亡途徑，稱之為鐵死亡。與細(xì)胞凋亡不同，鐵死亡是依賴鐵離子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的程序性死亡途徑，是一個全新的細(xì)胞死亡模式，這種鐵依賴性細(xì)胞死亡形式在生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)方面不同于凋亡、自噬、壞死、焦亡和其他細(xì)胞死亡方式。在其發(fā)生過程中，細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽耗竭，導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶4活性受到抑制，脂質(zhì)氧化物進(jìn)一步積累，同時過多的鐵離子發(fā)生Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生大量ROS，攻擊生物大分子，使細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡現(xiàn)象。鐵死亡可能是由特定的誘導(dǎo)物引起的，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin和RSL3均可以誘導(dǎo)鐵死亡，其特征是細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)ROS積累，并在形態(tài)學(xué)上以線粒體收縮為特征［6］。與這些研究類似，本研究發(fā)現(xiàn)FAC刺激同樣可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞出現(xiàn)線粒體收縮等鐵死亡特征性表現(xiàn)，同時表現(xiàn)出更低的礦化能力，但受影響的成骨細(xì)胞的線粒體形態(tài)變化是否嚴(yán)格與鐵離子濃度梯度相關(guān)仍不清楚，需要進(jìn)一步設(shè)置更多濃度梯度組進(jìn)行詳細(xì)探究。鐵死亡中脂質(zhì)過氧化的毒性可以被鐵螯合劑（如去鐵胺）或多種親脂原子團(tuán)（如維生素E、脂肪酶1）等中和。大量研究證實，氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中起顯著作用。因此，探討鐵死亡現(xiàn)象在骨質(zhì)疏松中的具體作用非常有意義，可以為骨質(zhì)疏松的臨床治療提供新的思路。

哺乳動物中MAPK家族主要包括ERK、p38和JNK等節(jié)點(diǎn)。MAPK的激活主要由其上游的MAPK激酶激活，也稱為MAP2K，而在MAP2K的上游還存在十幾種MAPK激酶，被稱為MAP3K。ASK1是近年來才被發(fā)現(xiàn)的一個MAPK途徑的上游激酶。研究表明，ASK1可被廣泛的細(xì)胞內(nèi)/外應(yīng)激激活，如寒冷刺激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和紫外線輻射等。最新研究［10］發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激也可以激活A(yù)SK1，其主要機(jī)制是通過抑制硫氧還蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。有文獻(xiàn)報道過氧化氫可以通過ASK1途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，學(xué)術(shù)界已經(jīng)公認(rèn)鐵蓄積會因Fenton反應(yīng)釋放大量的ROS，這表明ASK1作為p38的上游信號分子，與鐵離子的變化密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，高鐵刺激可以激活A(yù)SK1磷酸化，進(jìn)而引起下游p38磷酸化，從而激活這一MAPK相關(guān)通路，調(diào)控鐵死亡的發(fā)生。同時有研究［11］發(fā)現(xiàn)，鐵死亡與腦組織、腎臟和心臟組織的病理性細(xì)胞死亡相關(guān)，鐵死亡可能作為p53下游的內(nèi)源性腫瘤抑制機(jī)制，也可能利用鐵死亡的小分子激活劑選擇性消除Ras-Raf-MEK-ERK通路突變的癌細(xì)胞。雖然這個過程仍存在爭議，但是理解這種新的細(xì)胞死亡方式如何被調(diào)控是非常有意義的。

本研究存在一定的不足，缺少體內(nèi)實驗的驗證，同時對更多鐵離子濃度梯度以及鐵死亡過程中更深入的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的探索，這將是下一步研究的方向。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，高鐵刺激可以通過激活成骨細(xì)胞ASK1-p38信號通路，從而抑制了成骨細(xì)胞的功能，并與成骨細(xì)胞鐵死亡有關(guān)，這些結(jié)論為治療骨質(zhì)疏松提供了思路。