劉會(huì)締，李彥科，苗鵬，邢承忠

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸外科，沈陽 110001）

胃癌是世界范圍內(nèi)第五大常見腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡中排第3位［1］。2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國平均每年新增胃癌患者679 000例，因胃癌死亡人數(shù)達(dá)498 000例，僅次于肺癌［2］。因此，探尋胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及有效的治療靶點(diǎn)對(duì)改善胃癌患者的預(yù)后極為迫切。20世紀(jì)90年代，人們發(fā)現(xiàn)一類新型具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)并且無多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，將其命名為環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，circRNA的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠耐RNA外切酶和RNAse酶降解，因此與線性mRNA相比，circRNA具有更高的穩(wěn)定性。此外，越來越多的證據(jù)表明circRNA參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程，并可能成為癌癥的新型生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。如circPVT1能夠通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-199a-5p抑制膠質(zhì)瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，有望成為膠質(zhì)瘤潛在的治療靶點(diǎn)［5］；hsa_circ_0000518通過miR-326/FGFR1軸調(diào)控乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程，進(jìn)而成為乳腺癌治療靶標(biāo)［6］；在肝癌中敲除circHIPK3，能夠通過靶向miR-582-3p/DLX2抑制肝癌的致瘤性［7］。本研究鑒定了一個(gè)全新的circRNA——hsacirc_0018084（circZEB1），發(fā)現(xiàn)其在多種胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)，并檢測(cè)circZEB1在多種胃癌細(xì)胞和胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，探查其在胃癌細(xì)胞中的定位，并深入探索其在胃癌發(fā)展進(jìn)程中的生物學(xué)功能，為胃癌的臨床治療提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胃癌細(xì)胞系HGC-27、SGC-7901、AGS、MGC-823、MKN-45和正常上皮細(xì)胞系GES-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和PBS購自中國Hyclone公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；RNA提取試劑TRIzol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自日本Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。

實(shí)時(shí)PCR儀（LightCyclerR480Ⅱ）購自瑞士Roche公司）；酶標(biāo)儀（Model 680）購自美國Bio-Rad；流式細(xì)胞儀（FACS calibur）購自美國BD Bioscience。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每2 d更換1次完全培養(yǎng)基，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

在MGC-803和HGC-27細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染si-circZEB1以及陰性對(duì)照siRNA，48 h后用1 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞，配制含有8×104個(gè)細(xì)胞、4 mL的細(xì)胞懸液，充分顛倒混勻后，在si-circZEB1組和陰性對(duì)照組分別取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，置于37 ℃、濕度95%、含有5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。分別于0、24、48、72和96 h加入10 μL CCK-8試劑，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后利用酶標(biāo)儀測(cè)定si-circZEB1組和陰性對(duì)照組450 nm處的光密度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

在MGC-803和HGC-27細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染si-circZEB1和陰性對(duì)照siRNA，根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集并調(diào)整處理后的細(xì)胞濃度為1×106/mL，取1 mL細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞1次，離心去除上清，在細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇500 μL固定過夜，計(jì)算所需染色工作液體積，每個(gè)樣本用500 μL工作液孵育，將RNaseA和碘化丙啶按1∶9比例配制成染色工作液。室溫避光孵育30～60 min，上機(jī)檢測(cè)。比較si-circZEB1組和陰性對(duì)照組處于各個(gè)周期的細(xì)胞豐度。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

在MGC-803和HGC-27細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染si-circZEB1和陰性對(duì)照siRNA，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，用不含EDTA胰酶消化收集待處理細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，收集5×106個(gè)細(xì)胞。在50 μL的結(jié)合緩沖液中加入5 μL 7-AAD染液，混勻。在上述收集的細(xì)胞中加入7-AAD染液，混勻；室溫避光5～15 min。反應(yīng)后再加入450 μL結(jié)合緩沖液混勻。加入1 μL Annexin V-PE混勻，室溫、避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)。

1.6 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

分別檢測(cè)胃癌細(xì)胞系HGC-27、SGC-7901、AGS、MGC-823、MKN-45和正常上皮細(xì)胞系GES-1中circZEB1的內(nèi)源性表達(dá)含量。檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-circZEB1后的轉(zhuǎn)染效率。取出待處理細(xì)胞，利用TRIzol法提取待處理細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，最終合成cDNA于-20 ℃保存。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

應(yīng)用TRIzol試劑盒提取待處理細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，設(shè)置反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：β-actin，正向5’-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3’，反向5’-GTCA CCAACTGGGACGACAT-3’；circZEB1，正 向5’-TCC TGCACCAAGAAAGATCTGC-3’，反 向5’-TACAAAA CCTCGCGTTTCGC-3’；ZEB1，正向5’-AGCGAGGTA AAGTTGCGTCT-3’，反向5’-AGGTTTTCTGGGCCAT ACCG-3’。

1.8 細(xì)胞核質(zhì)分離純化實(shí)驗(yàn)

在胃癌細(xì)胞系MGC-803中檢測(cè)內(nèi)源性circZEB1的核質(zhì)表達(dá)豐度。根據(jù)細(xì)胞核質(zhì)分離純化試劑盒說明書，利用1 mL PBS吹刮下細(xì)胞并收集到1.5 mL去酶離心管中，4 ℃、600g離心5 min收集細(xì)胞。加入300 μL細(xì)胞核質(zhì)分離反沖液，吹勻懸液，冰上放置5 min，1 200g離心5 min，取上清于新管中，4 ℃、500g離心5 min去除雜質(zhì)，獲得純化細(xì)胞質(zhì)。沉淀部分加入300 μL沖洗液，4 ℃、1 200g離心5 min，取上清，重復(fù)一遍，加入300 μL細(xì)胞核質(zhì)分離反沖液重懸細(xì)胞核，獲得純化細(xì)胞核，接下來利用TRIzol法提取細(xì)胞核質(zhì)分離純化的RNA。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上。數(shù)據(jù)以表示。2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circZEB1的特征

circZEB1共有66 132個(gè)堿基，由位于10號(hào)染色體上的ZEB1基因的內(nèi)含子反向剪接而成，故將其命名為circZEB1。在MGC-803細(xì)胞系中利用細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circZEB1在細(xì)胞中的定位情況，發(fā)現(xiàn)circZEB1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中（圖1A）。在HGC-27、AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45以及GES-1細(xì)胞系中檢測(cè)circZEB1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在胃癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)（圖1B）。

圖1 circZEB1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)和定位Fig.1 Expression and localization of circZEB1 in gastric cancer cells

2.2 沉默circZEB1抑制胃癌細(xì)胞增殖

在MGC-803和HGC-27細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入si-circZEB1，并利用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，2種細(xì)胞系均能夠顯著沉默circZEB1的表達(dá)（圖2A）。進(jìn)一步利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circZEB1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲除circZEB1后能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力（圖2B）。

圖2 敲除circZEB1抑制胃癌細(xì)胞增殖Fig.2 circZEB1 knockout inhibits the proliferation of gastric cancer cells

2.3 沉默circZEB1促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

鑒于沉默circZEB1能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步在MGC-803和HGC-27細(xì)胞系中檢測(cè)circZEB1對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，沉默circZEB1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期（圖3）。這在一定程度上解釋了敲除circZEB1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用。

圖3 敲減circZEB1促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯Fig.3 circZEB1 knockdown promotes apoptosis and induces cell cycle arrest in gastric cancer cells

2.4 circZEB1通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-656調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡

通過circRNA靶miRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站Circular RNA Interactome（https：//circinteractome.irp.nia.nih.gov）發(fā)現(xiàn)，circZEB1可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-656。實(shí)時(shí)PCR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，沉默circZEB1后hsa-miR-656的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4A）。進(jìn)一步在胃癌MGC-803細(xì)胞系中利用熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circZEB1和hsamiR-656的直接靶向關(guān)系（圖4B）。由此提出假設(shè)，circZEB1可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-656調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力。

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR和熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)circZEB1和hsa_miR-656具有直接靶向關(guān)系Fig.4 Real-time quantitative PCR and luciferase reporter assay confirm the direct physical interaction between circZEB1 and hsamiR-656

3 討論

迄今為止，胃癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率仍高居不下，尤以我國為重。雖然近年來人們探索胃癌治療方案的腳步從未停止，但治療效果始終不甚顯著，胃癌患者的5年生存率仍低于30%［8］。因此，進(jìn)一步深入探索胃癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制以及尋找新的胃癌預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物意義重大。circRNA是近年新發(fā)現(xiàn)的一類具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA。與傳統(tǒng)線性mRNA相比，circRNA沒有5’末端帽子和3’末端poly尾巴結(jié)構(gòu)，其獨(dú)有的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其具有更強(qiáng)的抗消化作用和更高的穩(wěn)定性。因此，circRNA被認(rèn)為具有更高的研究潛能。

目前，人們發(fā)現(xiàn)circRNA能夠參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。如circFNDC3B能夠在結(jié)直腸癌中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-937-5p，調(diào)控TIMP3的表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程［9］；circ0000144能夠通過miR-217/AKT3信號(hào)通路，促進(jìn)甲狀腺癌的進(jìn)展［10］；胰腺癌中，hsa_circ_001587能夠通過海綿miR-223上調(diào)SLC4A4的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成，成為胰腺癌治療的潛在靶點(diǎn)［11］；circ0079593在黑色素瘤中高表達(dá)，并能夠通過miR-516b/GRM3軸促進(jìn)黑色素瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和糖代謝并抑制其凋亡［12］。

本研究鑒定了一個(gè)全新的circRNA——circZEB1。hsa_circ-0018084是由位于10號(hào)染色體上的ZEB1基因內(nèi)含子首尾剪接而成，其成熟序列共有66 132個(gè)堿基。利用細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，這暗示其更有可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA發(fā)揮作用。此外，本研究在多種胃癌細(xì)胞系和胃生理上皮細(xì)胞系中檢測(cè)了circZEB1的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與生理細(xì)胞系相比，其在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)，提示circZEB1在胃癌的發(fā)展進(jìn)程中更有可能發(fā)揮促癌作用。因此，本研究接下來檢測(cè)了其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。在MGC-803和HGC-27細(xì)胞系中敲除circZEB1后，與對(duì)照組相比，敲除circZEB1能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，敲除circZEB1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡；并且細(xì)胞周期結(jié)果表明，沉默circZEB1能夠?qū)⑽赴┘?xì)胞周期阻滯于G0/G1，這在一定程度上也解釋了circZEB1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的作用。鑒于circZEB1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，由此推測(cè)該circRNA更有可能通過海綿miRNA發(fā)揮功能。利用Circular RNA Interactome在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站，本研究發(fā)現(xiàn)circZEB1最有可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-656，進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)敲除circZEB1后hsa-miR-656表達(dá)顯著上調(diào)，并且熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了circZEB1與hsa-miR-656的直接靶向關(guān)系。由此做出假設(shè)，circZEB1可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-656，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，circZEB1主要表達(dá)在胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中，在胃癌細(xì)胞系中顯著上調(diào)，并通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-656調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和周期分布，影響胃癌發(fā)展進(jìn)程。因此，circZEB1有望成為胃癌治療的潛在治療靶點(diǎn)。