王濤，陶金，方燁紅，崔歡，馬超

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，北京 100005）

慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫（chronic compression of dorsal root ganglion，CCD）模型能夠最大程度模擬臨床腰椎間盤突出患者的癥狀［1］，是研究慢性神經(jīng)病理性疼痛的動物模型。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）初級感覺神經(jīng)元可以將皮膚感受致癢與致痛刺激通過外周軸突、中樞軸突傳遞給脊髓［2］。CCD可以增加感覺神經(jīng)元自發(fā)放電活動，提高神經(jīng)元胞體的興奮性，增強(qiáng)對溫度感受器和化學(xué)感受器刺激的反應(yīng)［3］。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于哺乳動物組織中，尤其在大腦皮質(zhì)及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高。5-HT受體分型比較復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)7種5-HT受體亞型［4］。5-HT在小鼠CCD模型中引起痛覺與癢覺敏化的作用機(jī)制仍不清楚，本研究探討CCD模型小鼠感受野注射5-HT產(chǎn)生痛覺敏化和癢覺敏化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6雄性小鼠24只，體質(zhì)量25～30 g，分別用于行為學(xué)實驗（低劑量組6只，高劑量組6只）、免疫熒光實驗（左側(cè)為對照側(cè)，右側(cè)為CCD手術(shù)側(cè)，n=6）、實時PCR實驗（左側(cè)為對照側(cè)，右側(cè)為CCD手術(shù)側(cè)，n=6）。小鼠飼養(yǎng)和實驗程序嚴(yán)格按照北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所的《實驗動物護(hù)理和使用指南》與相關(guān)的道德規(guī)范執(zhí)行，自由飲用清潔食物和水，維持12 h的晝夜循環(huán)。

1.2 小鼠CCD模型建立

3%異氟醚麻醉小鼠，沿背部中線切口，將腰椎旁的肌肉與乳頭突、橫突分離后暴露右側(cè)腰椎L3、L4椎間孔。將L形的不銹鋼棒（直徑=0.3 mm，長度=2 mm）插入每個孔中壓迫DRG［7］，誘導(dǎo)CCD。然后將切口分層縫合，局部涂抹含有抗生素（TriTop）軟膏。小鼠完成行為測試后氣體麻醉處死，移除神經(jīng)外膜并用生理鹽水沖洗后對接受CCD手術(shù)的DRG進(jìn)行顯微鏡檢查以確認(rèn)不銹鋼棒位置。

1.3 小鼠行為學(xué)分析

在一個圓柱形玻璃容器（直徑20 cm）底部放置泡沫，泡沫上面以直角放置2個小鏡子，以便能夠清楚看到小鼠的行為。實驗人員使用高清晰攝像機(jī)，分別在CCD前1 d和CCD后1、3、5、7 d記錄小鼠注射5-HT后的行為。每次實驗前將小鼠放在容器中適應(yīng)環(huán)境10 min，然后在小鼠右足皮內(nèi)注射10 μL 5-HT［8］（低劑量組：0.003 μg/10 μL，n=6；高劑量組：0.3 μg/10 μL），注射后立即開始記錄，持續(xù)記錄30 min。小鼠注射藥物產(chǎn)生傷害性（疼痛）感覺，會舔向注射部位，而瘙癢刺激能引起咬的行為。因此，通過錄像視頻計算舔和咬注射部位的累積持續(xù)時間來評估小鼠疼痛和癢的行為。

1.4 免疫熒光實驗

小鼠CCD術(shù)后5 d，用PBS和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后快速取出L3、L4的DRG，用4%多聚甲醛4℃固定4 h，然后放入30%蔗糖4 ℃過夜。OCT冷凍組織后切片（厚度12 μm）。冰凍切片37 ℃干燥1 h后室溫下4%多聚甲醛固定10 min。然后室溫下將載玻片在封閉溶液PBS（10%正常馬血清、0.2%Triton X-100）中封閉1 h，然后加入一抗兔抗小鼠HRH4（GTX78053，1∶400，美國GeneTex公司）4 ℃孵育過夜。第2天取出后PBS洗3次，每次5 min。然后室溫下加入二抗抗兔（A11011，Alexa 568共軛，美國Thermo Fisher公司）孵育1 h，隨后PBS清洗3次，使用含有DAPI封片劑封片（美國VECTASHIELD公司），使用Olympus顯微鏡拍攝圖像。

1.5 實時PCR檢測

按照試劑盒說明書，使用TRIzol試劑提取總RNA。以1 μg總RNA為原料，用Prime ScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser合成cDNA。使用SYBR1預(yù)混料Ex-TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）在25 μL反應(yīng)體積內(nèi)擴(kuò)增出感興趣基因和GAPDH。實時PCR條件為94 ℃ 30 s，40個周期，95 ℃ 5 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 5-HT對CCD小鼠痛行為的影響

結(jié)果顯示，與小鼠CCD手術(shù)前1 d比較，低劑量組小鼠CCD術(shù)后1、3 d痛行為增加（P＜ 0.05）；高劑量組小鼠CCD術(shù)后1 d痛行為增加（P＜ 0.05）。與低劑量組同時間比較，高劑量組痛行為明顯增加（均P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同劑量5-HT對CCD小鼠痛行為的影響（s）Tab.2 Effects of different 5-HT doses on pain responsive behavior in CCD mice（s）

2.2 5-HT對CCD小鼠癢行為的影響

結(jié)果顯示，與小鼠CCD手術(shù)前1 d比較，低劑量組小鼠CCD術(shù)后3 d癢行為增加顯著（P＜ 0.05）；而高劑量組小鼠CCD術(shù)后未見癢行為增加（P＞0.05）。與低劑量組同時間點比較，高劑量組小鼠癢行為明顯增加（均P＜ 0.05）。見表3。

表3 不同劑量5-HT對CCD小鼠癢行為的影響（s）Tab.3 Effects of different 5-HT doses on itching behavior in CCD mice（s）

2.3 CCD小鼠DRG中H4的表達(dá)

免疫熒光實驗結(jié)果顯示，對側(cè)正常DRG的628個神經(jīng)元中，H4陽性表達(dá)的神經(jīng)元145個（23.08%）；手術(shù)側(cè)DRG的685個神經(jīng)元中，H4陽性表達(dá)的神經(jīng)元241個（35.18%），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 小鼠L3和L4 DRG中H4陽性表達(dá)結(jié)果 ×200Fig.1 H4 protein expression in L3 and L4 DRG neurons in mice detected by immunofluorescence ×200

2.4 CCD小鼠DRG中5-HTr1a和5-HTr2a mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，對照組中5-HTr1amRNA、5-HTr2amRNA分別為20.20±2.18和13.01±1.25，CCD組DRG中5-HTr1a、5-HTr2amRNA分別為15.13±0.16和10.74±1.12，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.01）。

3 討論

5-HT可以通過2種方式引起瘙癢，一種是直接激活C類傷害性感受器，另一種是通過刺激皮膚的肥大細(xì)胞釋放組胺來引起瘙癢。本課題組前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，小鼠CCD模型中受壓迫DRG神經(jīng)元TRPV1表達(dá)上調(diào)，引起感受野對辣椒素誘發(fā)痛敏化。

CCD可以使小鼠受到正常感受力刺激后增加小鼠后足痛覺過敏的發(fā)生率［3，6］。大鼠在腰椎DRG發(fā)生CCD后或存在局部炎癥時出現(xiàn)機(jī)械行為超敏反應(yīng)［7］。DRG的自發(fā)活動研究［9］證實受壓迫DRG中感覺神經(jīng)元細(xì)胞體高度興奮，提高了對電、熱和化學(xué)傷害性刺激的反應(yīng)。研究［10］顯示，大鼠頸背部中線區(qū)域的瘙癢信號主要通過C3DRG傳入脊髓，5-HT受體發(fā)揮重要作用。另外，5-HT作為血管活性物質(zhì)參與偏頭痛的發(fā)生，以神經(jīng)遞質(zhì)的方式參與偏頭痛的痛覺調(diào)節(jié)［4］。有研究［11］表明大鼠外周感覺神經(jīng)元表達(dá)的5-HTr2a參與炎癥痛的形成。本研究結(jié)果顯示，與低劑量組比較，高劑量組小鼠CCD術(shù)后注射5-HT，痛、癢行為均明顯增強(qiáng)（P＜ 0.05），小鼠DRG中5-HTr1a和5-HTr2a表達(dá)明顯上調(diào)，與癢相關(guān)的組胺受體H4表達(dá)也明顯上調(diào)（均P＜ 0.05），表明5-HT參與了DRG神經(jīng)元壓迫后痛與癢覺敏化過程，抑制5-HT的產(chǎn)生有可能緩解CCD所引起的痛與癢覺的敏化過程。本研究為臨床治療慢性瘙癢與疼痛提供了一個可能的治療方案和潛在靶點。

綜上所述，CCD可引起小鼠痛覺與癢覺過敏，可能是由于受壓迫DRG神經(jīng)元H4、5-HTr1a和5-HTr2a表達(dá)上調(diào)，引起了感受野對5-HT誘發(fā)痛與癢的敏化所致。本研究存在的不足之處：給藥方式是皮下注射5-HT，通過刺激外周神經(jīng)末梢而不是直接作用DRG神經(jīng)元胞體，不能代表DRG神經(jīng)元對5-HT刺激的即刻反應(yīng)情況。今后需對DRG中5-HT產(chǎn)生反應(yīng)的單個神經(jīng)元進(jìn)行單細(xì)胞測序，進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。