張家紅，王金行，夏楠，李花

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，沈陽 110001）

活化部分凝血活酶時間（activated partial thrombo-plastin time，APTT）凝血試驗是將待測血漿和接觸凝血因子激活劑、磷脂、氯化鈣混合，記錄血漿凝固的時間，通常用于篩查內(nèi)源性和共同凝血途徑的凝血障礙。狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）是一種能與帶負(fù)電荷的磷脂或磷脂蛋白復(fù)合物結(jié)合的免疫球蛋白，屬于抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody，APL），可干擾依賴磷脂的體外凝血反應(yīng)［1］，其機制為血漿中的LA能中和APTT試劑中的磷脂，導(dǎo)致凝血反應(yīng)所需的磷脂量減少，凝血時間延長［2］。一般情況下，對于常規(guī)凝血試驗中的APTT單獨延長，首先應(yīng)進(jìn)行APTT糾正試驗，以區(qū)分內(nèi)源凝血因子缺乏或存在凝血抑制物，如懷疑為后者，則進(jìn)一步檢測LA或其他APL。然而，在實際工作中，APTT和LA同時檢測時，有相當(dāng)比例的患者APTT正常而LA陽性，而且制造商的試劑說明書中未標(biāo)明APTT對LA的靈敏度，這可能給部分臨床醫(yī)生或檢測人員造成困擾。本研究擬回顧分析改良的稀釋蝰蛇毒時間（diluted Russell viper venom time，DRVVT）法和硅凝固時間（silica clotting time，SCT）法檢測LA陽性且同時行常規(guī)APTT檢測的樣本數(shù)據(jù)，旨在評估本實驗室APTT對LA檢測的靈敏度和相關(guān)性，以期為臨床提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組

根據(jù)電子病歷和實驗室信息系統(tǒng)，收集2018年12月至2020年9月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的LA陽性病例386例，其中男62例，女324例，年齡9～87歲，中位年齡40（28～55）歲。386例LA陽性患者均同時進(jìn)行了APTT檢測，根據(jù)APTT參考區(qū)間（32.0～43.0 s）進(jìn)行分組：APTT正常（≤43.0 s）組177例，其中男28例，女149例；APTT延長（＞43.0 s）組209例，其中男34例，女175例。排除凝血因子缺乏、含凝血因子抗體、凝血酶時間延長、應(yīng)用抗凝藥物、肝病、血液病等。

1.2 樣本制備

采用含有0.3 mL濃度為0.109 mol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑的負(fù)壓采血管采取靜脈血2.7 mL（抗凝劑和血液的比例為1∶9），充分混勻。檢測APTT的采血管以2 000～2 500g離心10 min；檢測LA的采血管以2 000～2 500g離心10 min，且離心2次，檢測血漿均為乏血小板血漿樣本（血小板計數(shù)＜10×109/L）。

1.3 儀器、試劑與方法

1.3.1 APTT檢測：采用法國STAGO公司STA-REvolution儀器及相關(guān)配套試劑檢測APTT，試劑為凍干粉，激活物為硅土，含有標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量的兔腦磷脂。

1.3.2 LA檢測：采用美國IL公司TOP-750及相關(guān)配套試劑DRVVT法和SCT法檢測LA，2種方法均采用配套成對（篩選和確認(rèn)）試劑。DRVVT配套成對試劑為凍干粉，激活物為蝰蛇毒，篩選試劑和確認(rèn)試劑分別含有低濃度和高濃度的雙層磷脂。SCT配套成對試劑均為液體，激活物為硅膠，開瓶使用前將SCT確認(rèn)試劑充分混勻后吸取50 μL加入篩選試劑中，篩選試劑和確認(rèn)試劑分別含有低濃度和高濃度的合成磷脂。2種檢測LA方法的結(jié)果均以標(biāo)準(zhǔn)化比值（normalized ratio，NR）表示（篩選試驗比值=篩選試驗?zāi)獣r間/正常血漿凝血時間均值，確認(rèn)試驗比值=確認(rèn)試驗?zāi)獣r間/正常血漿凝血時間均值，NR=篩選試驗比值/確認(rèn)試驗比值，其中正常血漿來自40人份18～50歲的健康人群）。判定標(biāo)準(zhǔn)：DRVVTNR和SCT-NR任意一種方法的NR≥1.2即為LA陽性，1.2≤NR＜1.5為LA弱陽性，1.5≤NR＜2.0為LA中等陽性，NR≥2.0為LA強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0及GraphPad Prism.7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析、作圖。2組DRVVT-NR及SCT-NR均為非正態(tài)分布，以M（P25～P75）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析DRVVT-NR和SCT-NR預(yù)測APTT延長的臨界值、敏感度和特異度，采用Spearman秩相關(guān)方法分別分析APTT與DRVVT-NR及SCT-NR的相關(guān)性，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 386例LA陽性患者的疾病類型特征和樣本的基本參數(shù)比較

386例LA陽性患者的疾病類型包括以下4種：（1）血栓疾病，包括抗磷脂綜合征（62例）、腎靜脈血栓（1例）、主動脈血栓（1例）、動脈血栓顱內(nèi)占位病變（1例）；（2）結(jié)締組織病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（186例）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（27例）、干燥綜合征（30例）、血管炎（7例）、皮肌炎（3例）、硬皮?。?例）、其他結(jié)締組織?。?6例）；（3）病理妊娠，包括習(xí)慣性流產(chǎn)（3例）、宮內(nèi)胎兒發(fā)育停滯（1例）；（4）其他免疫性疾病，包括免疫性血小板減少（21例）、成人Still病（4例）。

APTT正常組與APTT延長組患者的性別、年齡、凝血酶原時間、纖維蛋白原、凝血酶時間及D-二聚體比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）；2組DRVVT-NR和SCT-NR比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表1、圖1。

圖1 2組NR的比較Fig.1 Comparison of NR in 2 groups

表1 386例LA陽性患者標(biāo)本各參數(shù)比較［M （P25～P75）］Tab.1 Comparison of parameters of 386 LA positive patients［M （P25-P75）］

2.2 ROC曲線分析

以APTT異常為判定標(biāo)準(zhǔn)，ROC曲線分析顯示，DRVVT-NR和SCT-NR預(yù)測APTT異常的臨界值分別為1.39和1.83，即APTT試驗對2種LA檢測方法靈敏度DRVVT-NR效能略高于SCT-NR。見表2、圖2。

圖2 DRVVT-NR和SCT -NR預(yù)測APTT延長ROC曲線Fig.2 Curve of DRVVT-NR and SCT -NR predicting APTT abnormal ROC

表2 NR預(yù)測APTT異常的ROC曲線分析Tab.2 ROC curve analysis of NR predicting abnormal APTT

2.3 APTT與DRVVT-NR及SCT -NR的相關(guān)性

采用Spearman秩相關(guān)方法，APTT與DRVVT-NR及SCT-NR的相關(guān)系數(shù)分別為0.702、0.641（P＜ 0.01）。見圖3。

圖3 APTT與DRVVT-NR及SCT-NR相關(guān)散點圖Fig.3 APTT and DRVVT-NR、SCT-NR correlation scatter diagram

3 討論

LA作為一種APL，目前不能定量檢測，是在排除其他可能的原因后通過推斷“檢測”到的，是一種功能性試驗［3］。由于目前尚無單一的檢測系統(tǒng)可以檢測到所有的LA，需要進(jìn)行2種不同檢測原理的試驗，以最大限度地提高其陽性檢出率［3-5］。本研究中，采用DRVVT和SCT兩步法檢測LA，其原理是應(yīng)用含有低濃度磷脂試劑的篩選試驗和含有高濃度磷脂試劑的確認(rèn)試驗。若血漿中存在LA，篩選試驗?zāi)獣r間延長，而確認(rèn)試驗則可完全中和血漿中的LA，使凝血時間縮短，結(jié)果顯示NR增高，提示LA存在。理論上，任何依賴于磷脂的試驗均適用于LA檢測。某些情況下，部分臨床醫(yī)生或?qū)嶒炇胰藛T可能會認(rèn)為LA陽性時APTT勢必延長，反之，APTT正常即可排除LA的存在。針對APTT和LA的關(guān)系，北美專業(yè)凝血實驗室協(xié)會的1項調(diào)查研究［6］顯示，多數(shù)實驗室LA檢測的靈敏度采用常規(guī)APTT評價，69%的實驗室反對“APTT正常即排除LA的存在”這一說法，31%的實驗室并不了解LA檢測的具體要求。本研究結(jié)果顯示，386例LA陽性樣本中，有45.9%APTT正常，故APTT正常并不能完全排除LA的存在。因此，正確解讀APTT和LA之間的關(guān)系可為臨床醫(yī)生提供有價值的咨詢。

常規(guī)凝血篩查用APTT試劑主要用于檢測凝血因子缺陷和肝素治療監(jiān)測，因含有的磷脂為非稀釋濃度磷脂和（或）合適的磷脂成分，影響其對LA的靈敏度［7］。APTT試劑中的磷脂類型、濃度及激活劑類型均可影響LA測定的靈敏度［8］。然而，KUMANO等［9］認(rèn)為LA測定的靈敏度依賴于磷脂濃度，與激活劑無關(guān)。通常在LA存在的情況下，與受LA影響的試劑相比，對LA不十分敏感的試劑所測得的凝血時間更短［10］。本研究中，APTT正常組的DRVVT-NR和SCT-NR多為弱陽性或中等陽性（表1、圖1），說明APTT對陽性程度不高的LA不敏感，這可能與APTT試劑含有標(biāo)準(zhǔn)濃度的磷脂有關(guān)。然而，有10例樣本LA強陽性，APTT卻在正常范圍內(nèi)；有的樣本APTT明顯延長，DRVVT-NR和SCT-NR升高程度差異卻很大（圖3），提示除了和APTT試劑的磷脂濃度和組成不同有關(guān)外，也可能跟LA的異質(zhì)性有關(guān)。有研究［11］報道，APTT試劑不變的情況下，不同LA的APTT延長程度差異很大。這種異質(zhì)性加上試劑間的可變性，可能導(dǎo)致在LA不變的情況下，用一種試劑檢測呈強陽性，而用另一種試劑檢測則呈弱陽性甚至陰性［7］。

既往文獻(xiàn)［11-12］評估APTT對LA的靈敏度多為同一水平LA陽性樣本采用多種試劑檢測，比較不同試劑的APTT值或其與正常APTT的比值，APTT值或其比值越高說明該試劑對LA越敏感，但這種靈敏度是相對的，不能提供APTT延長時LA的具體臨界值。本研究采用ROC曲線分析，通過DRVVT-NR和SCT-NR預(yù)測APTT延長時的臨界值（分別是1.39和1.83），即LA水平來反映APTT試驗的LA靈敏度，臨界值以下APTT試驗不敏感，反之則敏感（表2、圖2）。本研究結(jié)果還表明，APTT與DRVVT-NR和SCT-NR相關(guān)程度較強，呈顯著正相關(guān)（圖3）。YAO等［13］將大于APTT參考范圍10 s定為異常值，其異常程度與DRVVT、SCT顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.437、0.497（P＜0.01），與本研究結(jié)果相似。

由于LA的檢測尚無金標(biāo)準(zhǔn)，LA陽性定義為同一份血漿樣品基于DRVVT和（或）SCT的NR陽性結(jié)果，不能排除LA假陽性或假陰性。本研究存在一定的局限性，如APTT、DRVVT篩選和確認(rèn)試劑的說明書中未提供有關(guān)磷脂的具體濃度，只以粗略的標(biāo)準(zhǔn)濃度表示，而SCT成套配對試劑開瓶使用前需將SCT確認(rèn)試劑充分混勻后吸取50 μL加入篩選試劑中，故而認(rèn)為篩選試劑中所含磷脂濃度較低，確認(rèn)試劑中所含磷脂濃度較高，可能造成一定的人為因素干擾；另外，作為回顧性研究，通過電子病歷和實驗室信息系統(tǒng)采集的信息可能存在回顧性信息偏倚。

綜上所述，在LA陽性樣本中，常規(guī)APTT試劑和檢測LA的DRVVT、SCT試劑磷脂的濃度、組成不同以及LA的異質(zhì)性均可能導(dǎo)致對LA檢測的靈敏度不同。了解實驗室APTT試劑對LA檢測的靈敏度及其相關(guān)性，合理解釋APTT與LA檢測結(jié)果之間的關(guān)系，具有實際臨床應(yīng)用價值。