李香雨，于漫，聶梓陶，陳彥如，王嘉會，韓喜彬，趙微

（錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121200）

星狀病毒是引起嬰幼兒及免疫缺陷人群腹瀉的重要病原體，發(fā)病率僅次于輪狀病毒，常與其他腸道病毒混合感染，造成患兒嚴重腹瀉甚至死亡［1］。由于星狀病毒屬于食源性和醫(yī)院獲得性病原體，常呈現(xiàn)群體爆發(fā)感染，嚴重危害公共衛(wèi)生安全［2-3］。

星狀病毒為星狀病毒科無囊膜、單股、正鏈RNA病毒。人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）具有8個傳統(tǒng)的血清型（HAstV 1～8）及3種新的亞型（MLB型、VA型及HMO型）［4］。其中，HAstV-1型在嬰幼兒群體中感染最為普遍［5］。HAstV基因組編碼非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1a（編碼3C-like 絲氨酸蛋白酶）、非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1b（編碼RNA依賴性的RNA聚合酶RdRp）和結(jié)構(gòu)蛋白ORF2（編碼病毒衣殼蛋白）3種蛋白。ORF2蛋白主要決定了細胞的嗜異性，并能夠刺激宿主細胞產(chǎn)生應(yīng)答，是參與調(diào)控細胞基因的轉(zhuǎn)錄與表達及參與病毒受體結(jié)合的重要成分，在病毒粒子的成熟和包裝中起重要作用［6-8］，因此，以O(shè)RF2為靶基因篩選與之互作的蛋白具有重要意義。

酵母雙雜交系統(tǒng)是基于轉(zhuǎn)錄因子對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用進行篩選與鑒定的系統(tǒng)，已被廣泛應(yīng)用于病毒與宿主的互作研究［9-10］。本研究利用實驗室分離到的HAstV-1型1d亞株作為模板，將病毒衣殼蛋白ORF2基因成功克隆到酵母雙雜交表達載體pGBKT7中，并以O(shè)RF2作為誘餌蛋白，從人結(jié)腸癌細胞Caco-2 cDNA文庫中初步鑒定與ORF2存在相互作用的宿主蛋白，為進一步研究ORF2的生物學(xué)功能及參與病毒致病性等方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HAstV-1d病毒株、人Caco-2 cDNA 文庫、Caco-2細胞、pMD-18T-ORF2質(zhì)粒為本實驗室保存。Y2H 酵母感受態(tài)細胞、膠回收試劑盒、Prime STAR HS DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、SalⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker、2×蛋白上樣緩沖液，均購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7、pGADT7-T、酵母質(zhì)粒小提試劑盒和酵母雙雜交試劑盒及各種營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基均購自美國Clontech公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo 公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國GIBCO 公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pGBKT7-ORF2誘餌表達載體：以HAstV-1d病毒株衣殼蛋白pMD-18T-ORF2質(zhì)粒作為模板，設(shè)計針對ORF2的PCR引物，ORF-F引物序列為5’-CA TATGATGGCTAGCAAGTCCAATAAGCAGGTAA CT-3’；ORF-R引物序列為5’-GTCGACCTCGGCGTG GCCGCGGCTTCCAGAAGT-3’。分別用Prime STAR HS DNA聚合酶進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測、回收，用 NdeⅠ和SalⅠ對PCR產(chǎn)物和pGBKT7質(zhì)粒分別進行雙酶切、鑒定、回收。再經(jīng)T4 連接酶連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。用檢測引物ORF-F和ORF-R對得到的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠檢測，并將陽性轉(zhuǎn)化子送上海杰李公司進行測序。

1.2.2 誘餌蛋白自激活性鑒定：將pGBKT7-ORF2和pGADT7共轉(zhuǎn)化至Y2H Gold中，以pGADT7-T和pGADT7-53作為陽性對照、pGBKT7-Lam 和pGADT7-T作為陰性對照。轉(zhuǎn)化菌液于SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。觀察是否有藍色克隆菌生長，判斷是否有自激活及毒性作用。

1.2.3 酵母雙雜交篩選與鑒定：酵母雙雜交篩選按照說明書進行。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-ORF2轉(zhuǎn)化至Y2H酵母感受態(tài)細胞，并接種到全培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，OD600值達到1時收集細胞。用5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基進行重懸，加入 1 mL Caco-2 cDNA 文庫（克隆數(shù)＞2×107）。培養(yǎng) 24 h 后，取少許菌液在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，判斷是否融合。將融合的菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His培養(yǎng)基進行初步篩選，獲得的陽性菌落涂布于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，進行第二次篩選。挑選二次篩選到的陽性菌落接種到 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-gal培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng) 3～5 d，進一步篩選。陽性菌落，經(jīng)菌液 PCR 擴增ORF2基因，回收后送上海杰李公司進行序列測定。獲得的序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行檢索與對比，確定互作蛋白的基因序列信息。

2 結(jié)果

2.1 酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-ORF2的鑒定

用ORF-R與ORF-F引物對已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGBKT7-ORF2進行菌落PCR檢測，可擴增出2 364 bp的片段（圖1A），測序結(jié)果與HAstV-1d上傳 GenBank的ORF2基因片段（GenBank：KF211475.1）序列一致，說明pGBKT7-ORF2誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定、瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)大小為2 364 bp目的條帶（圖1B），與預(yù)期相符。

圖1 誘餌載體pGBKT7-ORF2的鑒定Fig.1 Detection of bait plasmid pGBKT7-ORF2 by PCR

2.2 誘餌質(zhì)粒自激活和毒性檢測

pGBKT7-ORF2和pGADT7、pGADT7-T和pGADT7-53（陽性對照）、pGBKT7-Lam 和pGADT7-T（陰性對照）菌落均能在SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上生長，而僅有pGADT7-T和pGADT7-53在SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上生長，其余均無菌落生長（圖2）。說明ORF2蛋白不能激活酵母菌下游基因，不具有自激活性。

將含pGBKT7-ORF2和pGBKT7質(zhì)粒的Y2H酵母菌涂布于SD/-Leu/-Trp 培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，結(jié)果顯示，pGBKT7-ORF2重組菌與空載體pGBKT7的菌落大小和數(shù)量基本一致（圖2B、2C），表明ORF2蛋白對菌體明顯無毒性。

圖2 誘餌質(zhì)粒自激活和毒性檢測Fig.2 Toxicity and the activation test of pGBKT7-ORF2

2.3 篩選與ORF2 蛋白互作的宿主蛋白

將pGBKT7-ORF2轉(zhuǎn)化的Y2H酵母菌和Caco-2 cDNA文庫融合得到的菌液涂布于不同報告基因缺失的固體平板進行表型鑒定（圖3A）。經(jīng)過4輪缺失培養(yǎng)基篩選獲得克隆，將Caco-2細胞cDNA文庫轉(zhuǎn)化產(chǎn)物104倍稀釋后，在SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基平板進行培養(yǎng)，得到了14個陽性克隆菌（圖3B），總篩選克隆數(shù)為1.4×105。

圖3 以pGBKT7-ORF2為誘餌篩選Caco2細胞cDNA文庫Fig.3 Screening of Caco2 cell cDNA library

2.4 陽性克隆菌的回轉(zhuǎn)驗證及測序分析

對獲得的陽性克隆菌行2次回轉(zhuǎn)驗證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化的菌株能夠在 SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長，且在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba平板上菌落呈藍色，與陽性對照結(jié)果一致（圖4）。經(jīng)測序鑒定得到陽性菌的基因序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進行比對分析，獲得15種蛋白，見表1。

表1 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與ORF2互作的蛋白質(zhì)Tab.1 Screening of proteins interacting with ORF2 by yeast two-hybrid system

圖4 陽性克隆回轉(zhuǎn)驗證Fig.4 Return test of pGBKT7-ORF2 proreins

3 討論

星狀病毒ORF2蛋白主要決定了細胞的嗜異性，并能夠刺激宿主細胞產(chǎn)生應(yīng)答，參與病毒粒子的裝配、核酸的包裝、病毒粒子的成熟［11-12］。目前關(guān)于星狀病毒衣殼蛋白與宿主相互作用的報道較少，通過對其結(jié)構(gòu)基因的預(yù)測表明，ORF2蛋白的C端與某些病毒相關(guān)蛋白和受體具有結(jié)構(gòu)上的相似性［13］，可能參與病毒與受體的結(jié)合。

星狀病毒的宿主細胞為Caco-2，該細胞體外培養(yǎng)條件下可自發(fā)上皮樣分化，形成與小腸上皮細胞相同的微絨毛結(jié)構(gòu)和緊密連接，與小腸柱狀上皮細胞很相似。因此，本研究選擇Caco-2細胞構(gòu)建cDNA文庫，進行宿主蛋白篩選［14］。以星狀病毒的ORF2蛋白作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)在Caco-2細胞的cDNA文庫中篩選出與ORF2蛋白互作的15種蛋白。對15種蛋白進行了初步功能分析和文獻檢索，其中，纖維連接蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N）與病毒感染具有相關(guān)性［15］。FN1的細胞型是細胞外基質(zhì)的重要組成部分，在細胞形態(tài)形成、遷移、炎癥和表面受體內(nèi)化等方面發(fā)揮作用［16-18］。文獻［19］報道，F(xiàn)N與EV71 病毒顆粒有直接的相互作用，通過促進EV71的入侵促進EV71的感染。而流感病毒H1N1入侵宿主時需要FN的參與［20］。FN能與乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）的S抗原相互作用，促進其與細胞表面結(jié)合［21-22］，并且還可能參與HBV的入侵［23］。而FN1與星狀病毒互作后對病毒感染有何影響目前尚無報道，有待進一步深入研究。

本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選并鑒定出與HAstV-1 ORF2蛋白互作蛋白。后續(xù)將進一步對其中感興趣的蛋白，尤其是FN1與ORF2的互作進行免疫共沉淀檢測，并進行基因功能分析，為研究星狀病毒與宿主相互作用、ORF2蛋白功能及病毒的致病機制奠定基礎(chǔ)。