王景莉 馮保靜

年輕恒牙及未完全發(fā)育牙齒因齲病或牙外傷導(dǎo)致牙髓壞死或根尖周炎，其治療措施包括傳統(tǒng)的根尖屏障術(shù)、根尖誘導(dǎo)成形術(shù)以及近年來實施的牙髓血運重建，其生物學(xué)基礎(chǔ)是根尖區(qū)組織含有大量前體細胞。Sonoyama 等[1]首先將這部分處于未分化狀態(tài)的前體細胞分離培養(yǎng)，并命名為根尖牙乳頭干細胞（stem cells from apical papilla,SCAPs），進一步研究發(fā)現(xiàn)其具有高增殖率、較強的自我更新能力和多向分化潛能。研究顯示SCAPs長期高表達抗凋亡蛋白及端粒逆轉(zhuǎn)錄酶，且來源于同一牙齒的SCAPs 較其他牙源性干細胞具有更強的增殖、分化能力[1-3]。另外，SCAPs具備更強的抗感染能力，當牙髓組織感染將導(dǎo)致牙髓干細胞失去活力，SCAPs 仍可繼續(xù)保持其活性，這是由于其所處的生長環(huán)境血運側(cè)支循環(huán)較髓腔內(nèi)的牙髓干細胞更為豐富[4]。SCAPs 作為組織工程中極具潛力的種子細胞，其出現(xiàn)為牙齒修復(fù)再生及組織重建再生提供了新的思路。

CGF 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型血液來源的生物支架材料，由靜脈取血后通過差速離心制作而成[5]。CGF 作為繼富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）、富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）后的新一代血小板濃縮物，其不僅是新一代生物支架材料，富含多種高濃縮的纖維蛋白（fibrous protein）及生長因子（growth factor），包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor,PDGF）、轉(zhuǎn)移生長因子-β（Transferring growth factor-β,TGF-β）、類胰島素生長因子（insulin-like growth factor,IGF）以及成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors,FGF）等[6]。研究報道CGF 既有利于骨髓間充質(zhì)干細胞的分化，又能促進牙齦細胞增殖、粘附及膠原纖維的合成，加快軟組織愈合[7-8]。另外，CGF 的制備不需要特殊的添加劑，其纖維蛋白的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與天然纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)更加相似，制備后捕獲的多種生長因子可在后期節(jié)律性緩慢釋放[6,9]，使得CGF 在牙髓損傷修復(fù)及及組織工程再生領(lǐng)域具有廣闊臨床應(yīng)用前景。

目前研究發(fā)現(xiàn)自體CGF 可顯著促進SCAPs增殖、遷移及成骨向分化，但患有貧血等血液疾病者其自體CGF 的使用受到了限制，那么異體CGF 是否能夠發(fā)揮同樣的作用尚不明確，為闡明人異體CGF 對SCAPs 影響的差異，本實驗通過制取異體CGF，檢測其對SCAPs 生物學(xué)特性的影響，為異體CGF的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶細胞消化液、α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；CCK-8（DOJINDO，日本）；ALP試劑盒（碧云天，中國）；紫外線分光光度儀（Eppendorf，德國）；細胞培養(yǎng)板（Costar，美國）；實時定量PCR儀（ABI，美國）；細胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；胎牛血清（FBS）；（Hyclone，美國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-TEK，美國）；細胞培養(yǎng)板（Costar，美國）；CD29、CD90、CD105、CD34、CD45（BIOLEGEND，美國）；牛血清白蛋白（BSA)（Biosharp，中國）。

1.2 hSCAPs 的分離、培養(yǎng)及鑒定 口腔頜面外科收集12名15-22歲志愿者正畸拔除前磨牙及第三磨牙，要求牙齒完整無齲壞且根尖未發(fā)育完全，其中6名志愿者同期抽取靜脈血，進行自體CGF 膜片制備。拔除牙齒立即放入冰浴PBS 中，超凈臺內(nèi)反復(fù)沖洗牙齒表面并去除牙齦、牙周膜軟組織，使用手術(shù)刀片分離出根尖牙乳頭組織放入1.5mL EP 管，使用眼科剪將根尖牙乳頭組織塊剪碎至1mm3大小，加入Ⅰ型膠原酶（3mg/mL），輕柔混勻后放入37℃細胞培養(yǎng)箱中消化45min，10min使用移液槍混勻一次，終止消化、離心去上清，細胞重懸并接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞融合率達80%左右時，擴大培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

流式細胞術(shù)鑒定：取第3代hSCAP接種于培養(yǎng)瓶，當hSCAP融合率達80%左右，消化細胞為單細胞懸液后離心，0.5%牛血清白蛋白（BSA）重懸細胞，在流式細胞儀樣品管中分別加入1mL細胞懸液（1×106個/mL），常溫下孵育細胞懸液與目標抗體（CD29、CD90、CD105、CD34、CD45、IgG）1h，1000r/min離心后去上清，PBS洗脫未結(jié)合抗體，上機檢測表面標記物。

hSCAPs 成骨向誘導(dǎo)及成脂向誘導(dǎo)培養(yǎng)：當根尖牙乳頭干細胞生長融合率達80%左右時，將完全培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基[9]，定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后使用4%多聚甲醛固定細胞15min，使用三蒸水洗脫殘留多聚甲醛，參照茜素紅及油紅O染色說明書進行染色，顯微鏡下觀察并記錄脂滴及鈣化結(jié)節(jié)形成情況。

1.3 CGF膜片的制備 經(jīng)安陽市第六人民醫(yī)院倫理委員會審批同意，在口腔頜面外科招募12名15-22歲男性志愿者，要求身體健康，無系統(tǒng)性疾病，使用真空采血試管采取其中6名志愿者前臂靜脈血，其余6名志愿者拔除前磨牙或第三磨牙，進行根尖牙乳頭干細胞培養(yǎng)。采血管放入離心機，不間斷差速離心13min，即可得到CGF 纖維蛋白層，此時可見真空管內(nèi)血液分為三層，中間層即為CGF凝膠。采血管內(nèi)取出CGF凝膠，制備CGF膜，裁剪備用。hSCAPs 患者之外志愿者來源的CGF 為異體CGF（homogenous CGF,H-CGF）。

1.4 CCK8檢測細胞增殖 將異體CGF膜裁剪至標準膜的1/2 及1/4 大小，并置于96 孔板中，取20μl 濃度為5×105/ml 的細胞懸液接種于96 孔板不同體積的異體CGF 上，培養(yǎng)箱中靜置2h，待細胞附著后，補加培養(yǎng)基至l00μl，繼續(xù)培養(yǎng)7d 后，更換為CCK-8 工作液孵育2h，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組在1、3、5、7d時450nm處吸光度（OD）值。

1.5 ALP 活性檢測 將異體CGF 置于6 孔板中，狀態(tài)良好的細胞消化離心，并使用不同的培養(yǎng)基重懸，空白對照組（Con）使用單純α-MEM 重懸細胞，成骨誘導(dǎo)組（Osteogenic differentiation Medium,OM）及CGF 組均使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細胞，接種于6 孔板及異體CGF 上培養(yǎng)24h，然后更換為成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)7d、14d，對照組（Con）更換為不含CGF 膜的成骨誘導(dǎo)液，根據(jù)說明書測定各組ALP活性。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測成骨/成牙基因表達 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)7d，提取細胞總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，采用Real Time-PCR 檢測各組ALP、DSPP、BSP、OCN 成骨/成牙相關(guān)基因的表達，以β-actin 為內(nèi)參基因。Real Time-PCR 反應(yīng)條件及反應(yīng)體系參照說明書操作，引物序列見表1。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列

1.7 Transwell 檢測細胞遷移采用無血清a-MEM 和完全培養(yǎng)基重懸細胞，不含血清的a-MEM 為空白對照組（Con），含10%FBS 的a-MEM 為陽性對照組（positive group,PG），含10%FBS 的a-MEM 加CGF 膜片為H-CGF 組，在24 孔板Transwell 小室的下層加入600μL 培養(yǎng)液及異體CGF 膜，取150μL（5×104/ml）細胞懸液接種于小室，培養(yǎng)24h 后，多聚甲醛固定小室上遷移的細胞，用小棉簽擦去小室上層為遷移細胞，1g/L結(jié)晶紫染色液20min，清洗后顯微鏡下觀察并記錄細胞遷移數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)作單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗或方差分析，實驗均各重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為均數(shù)±標準差，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 hSCAPs 的培養(yǎng)及鑒定hSCAPs 成骨、成脂向誘導(dǎo)4 周后，茜素紅染色可見成骨誘導(dǎo)組細胞可形成大量鈣化結(jié)節(jié)（圖1），而油紅O 染色可見成脂誘導(dǎo)組細胞內(nèi)有紅色脂滴形成（圖2），說明hSCAPs具有多向分化潛能。流式結(jié)果顯示干細胞表面標記分子CD105、CD90、CD29呈陽性表達，而血細胞標記分子CD34、CD45 則呈陰性表達，符合間充質(zhì)干細胞的表面分子表達特性（圖3）。

2.2 CGF對hSCAPs增殖能力的影響

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，異體CGF 組（H-CGF）和對照組在培養(yǎng)hSCAPs 1、3、5、7d 時，不同濃度的H-CGF 均明顯高于其對照組的OD值，表明CGF 可提高hSCAPs 的增殖率（P<0.05)；但不同膜片大小的H-CGF 組間無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05)，提示促進hSCAPs 增殖能力的CGF不具有濃度依賴性（圖4)。

2.3 CGF 對hSCAPs成骨/成牙能力的影響

成骨誘導(dǎo)組（OM）的ALP 活性在hSCAPs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d、14d 時均明顯高于空白對照組（P<0.05)，且H-CGF 組的ALP 活性顯著高于OM 組（P<0.05)，(圖5)。qPCR 檢測結(jié)果顯示H-CGF 組中成骨基因ALP、DSPP、BSP、OCN mRNA 的表達均明顯高于OM 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)，(圖6)。

2.4 CGF 對hSCAPs遷移能力的影響

Transwell 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對照組（PG）遷移至下室的細胞數(shù)目明顯高于空白對照組（Con）(P<0.05)，且H-CGF 組遷移至下室的細胞數(shù)目均明顯高于陽性對照組（PG）(P<0.05),(圖7)。

3.討論

SCAPs 位于牙根未發(fā)育完全的年輕恒牙及乳牙中，其具有高度增殖能力和成骨/成牙分化能力，在牙根發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)將SCAPs復(fù)合培養(yǎng)于羥基磷灰石（HA-TCP）支架材料后植入裸鼠皮下，4-8 周后可形成類牙齒樣結(jié)構(gòu)[11]，提示SCAPs 在牙齒修復(fù)再生及組織重建中起著重要作用。

由于CGF 具備更加接近天然結(jié)構(gòu)的纖維網(wǎng)狀支架，并能更好的富集高濃度生長因子，使得CGF迅速成為研究熱點[12]。此外，CGF 纖維支架中各組生長因子的釋放更接近組織愈合的自然過程，在軟、硬組織愈合過程中的發(fā)揮的作用更強[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CGF 刺激間充質(zhì)干細胞后，可通過TGF-β/BMP、Wnt/β-catenin 等通路上調(diào)干細胞內(nèi)成骨基因的表達，進而調(diào)控細胞成骨向分化，促進骨組織再生[13]。Hong 等[14]發(fā)現(xiàn)，CGF 內(nèi)的細胞因子可趨化牙髓干細胞聚集，促進細胞增殖和分化，在根尖周炎中炎癥性牙髓的再生中發(fā)揮重要作用。Ding 等臨床研究表明CGF 在牙髓再生治療中可發(fā)揮緩慢釋放細胞生長因子和作為細胞生長支架的雙重作用，不僅能替代牙髓血運重建傳統(tǒng)治療中的血凝塊，還可提高牙髓再生治療的成功率[15]。體外研究顯示自體CGF 可促進PDLSC 的增殖、成骨向分化能力[16]，而hSCAP 在牙根的形成和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是根尖誘導(dǎo)成形術(shù)中牙根繼續(xù)發(fā)育的重要細胞來源，明確CGF 對SCAP 生物學(xué)特性的影響對CGF 在牙組織工程中的應(yīng)用具有重要意義。

本研究選取異體CGF對hSCAPs進行培養(yǎng)，檢測hSCAPs 的增殖、遷移及成骨/成牙分化等生物學(xué)特性。CCK8 實驗結(jié)果顯示，異體CGF 在第1、3、5、7d均可明顯促進hSCAPs的增殖。此外，本研究發(fā)現(xiàn)異體CGF 對SCAPs 成骨/成牙向分化具有顯著促進作用。細胞遷移實驗則顯示異體CGF 對hSCAPs 遷移能力具有明顯促進作用。研究表明，制備CGF 過程中，真空離心管的不同規(guī)格可使最終獲得的CGF 纖維支架具有一定的差異[17]，并且不同志愿者的身體狀況、年齡、性別及生活習(xí)慣等差異較大，則制備出的CGF 在濃度和活性方面也會產(chǎn)生較大差異[18]；因此，本實驗制備CGF 時選用18-20歲健康男性志愿者，并采用同一批次靜脈血采集管，以減少年齡、性別差異引起的實驗誤差。

綜上，CGF 作為繼PRP 和PRF 后的最新一代血小板纖維蛋白濃縮物，其類似天然的支架結(jié)構(gòu)可為細胞提供生長及增殖的空間，且富含多種細胞生長因子并具有可吸收性生物膜的特性，在牙髓-牙本質(zhì)再生中可發(fā)揮重要作用。本研究顯示異體CGF 可明顯促進SCAPs 增殖、遷移能力，增加堿性磷酸酶活性、提高成骨/成牙相關(guān)基因的表達水平，促進成骨/成牙向分化，為異體CGF 在口腔組織工程的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。