摘要：血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HI）屬獸醫(yī)實驗室檢測禽流感、新城疫等家禽A類疫病常規(guī)方法，但在具體操作階段，一旦操作不規(guī)范極有可能降低試驗檢測結(jié)果精準程度，弱化工作效率。該文主要論述禽流感和新城疫血凝抑制試驗檢測方法。

關鍵詞：禽流感;新城疫;血凝抑制試驗;檢測方法

中圖分類號：S855.3? ? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.005

Methods of Hemagglutination Inhibition Test for Avian Influenza and Newcastle Disease

Abstract：Hemagglutination test （Ha） and hemagglutination inhibition test （Hi） are routine methods in veterinary laboratory to detect avian influenza and Newcastle disease，if the operation is not standardized enough，the accuracy of test results will be reduced and the work efficiency will be weakened.The methods of hemagglutination inhibition test for avian influenza and Newcastle disease were discussed in this paper.

Keywords：avian influenza，newcastle disease，hemagglutination inhibition test，detection method

引言

禽流感和新城疫是家禽養(yǎng)殖過程中的常見病，是重大禽類傳染病之一。需做好家禽A類常見疫病的常規(guī)檢測方法，但在實際操作中，易出現(xiàn)不規(guī)范的問題，降低了試驗檢測結(jié)果精準程度。提供一種禽流感和新城疫的血凝抑制試驗檢測方法，可克服現(xiàn)有技術不足，從根本上保證診斷技術檢測結(jié)果精準程度。

1 采集與血樣處理

1.1 紅細胞準備

1%雞紅細胞懸液的制備包括用阿氏液作為抗凝劑，選擇3只無特定病原微生物（SPF）、無禽流感癥狀、新城疫抗體的非免疫公雞的抗凝血液作為研究對象，加入試管中，隨即加入抗凝血液3倍的緩沖液（PBS）進行充分混合，離心速度保持在2 000 r/min，持續(xù)5～10 min，去除血漿、白細胞層，重復上述過程并反復沖洗3次，將血漿、白細胞清洗干凈，離心速度控制為2 000 r/min，持續(xù)10 min，吸取適當?shù)膲悍e紅細胞配合使用PBS制備質(zhì)量分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液，在恒溫4 ℃條件下保存。選取2.05 g葡萄糖、0.8 g檸檬酸鈉、0.055 g檸檬酸、0.42 g氯化鈉加入100 mL的蒸餾水中，直至充分散熱溶解，維持pH在6.1并充分溶解，在壓強6.9 kPa條件下持續(xù)15 min高壓滅菌，在恒溫4 ℃條件下保存。配置的醛化紅細胞液質(zhì)量分數(shù)為0.75%，加入到濃度為0.1%，恒溫4 ℃，吸取適當?shù)膲悍e紅細胞配合使用PBS制備質(zhì)量分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液，在恒溫4 ℃條件下保存。加入到濃度為0.1%的疊氮鈉中備用。

1.2 血清準備

受檢樣品為山東望聯(lián)種禽集團有限公司肉種雞血清，原始編號為1～30，于2020年9月15日免疫高致病性禽流感三價滅活苗（H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9（H7-RE2株），青島易邦生物工程有限公司，生產(chǎn)批號201384900;于2020年9月25日免疫新城疫凍干活疫苗，青島易邦生物工程有限公司，生產(chǎn)批號200333110。

1.3 檢測試劑準備

使用哈爾濱國生生物科技股份有限公司生產(chǎn)禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗抗原，生產(chǎn)批號20190415，血凝效價8log2，和青島立見診斷技術發(fā)展中心生產(chǎn)的新城疫血凝抑制試驗抗原，生產(chǎn)批號010131801;血凝效價為10log2。

1.4 檢測方法

（1）設禽流感血凝抑制試驗固定的參照血凝效價為11log2，設新城疫血凝抑制試驗固定的參照血凝效價為12log2。

（2）配制禽流感參照血凝效價11log2或新城疫參照血凝效價12log2的4HAU抗原。

（3）取2個96孔V型微量反應板橫向相鄰放置，第2個96孔V型微量反應板作為第1個板的加長，用移液器在第1～15孔各加入0.025 mL PBS，第16孔加入0.05 mL PBS。

（4）第1孔中加入0.025 mL標準的禽流感、新城域陽性血清，經(jīng)過充分混合后取出0.025 mL放置到第2孔中，直至第14孔，并且需要從第14孔中取出0.025 mL拋棄，第15孔作為陽性參照，第16孔作為PBS對照。

（5）1～15孔中均加入0.025 mL的L4HAU抗原，輕觸反應板，實現(xiàn)反應物的充分混合，溫度環(huán)境控制在20～25 ℃環(huán)境下靜置，持續(xù)30 min，也可以選擇在恒溫4 ℃條件下持續(xù)靜置1 h;20～25 ℃室溫下靜置35～45 min，或在恒溫35～40 ℃條件下靜置持續(xù)12～18 min，PBS與孔紅細胞對比呈現(xiàn)出顯著的鈕扣形狀沉積到底，此時判定結(jié)果。

1.5 判定結(jié)果

PBS正確的前提下，傾斜反應板，從背側(cè)角度觀察，1～3 s內(nèi)觀察紅細胞是否以淚珠狀落下，在陰性血清與標準抗原對照的HI滴度≤2log2的情況下，陽性血清和標準抗原進行對照，與已知滴度相差大約1個稀釋度，在陰陽血清均不發(fā)生自凝的前提下，判定HI結(jié)果有效，記錄試驗抗體效價數(shù)值。

禽流感抗體效價公式：參照血凝效價11log2比正確血凝效價數(shù)值多Y個滴度，禽流感抗體效價=（試驗抗體效價數(shù)值-Y）log2，Y=0、1、2、3、4。

新城疫抗體效價公式：參照血凝效價12log2比正確血凝效價數(shù)值多Y個滴度，新城疫抗體效價=（試驗抗體效價數(shù)值-Y）log2，Y=0、1、2、3、4。

禽流感抗體效價公式或新城疫抗體效價公式中，若計算出的禽流感抗體效價或新城疫抗體效價大于10，則禽流感抗體效價或新城疫抗體效價記為10log2;若禽流感抗體效價或新城疫抗體效價小于或等于3log2，則判定抗體試驗為陰性;若禽流感抗體效價或新城疫抗體效價等于4log2，則判定抗體試驗為可疑，需重復試驗;若禽流感抗體效價或新城疫抗體效價大于或等于5log2，則判定抗體試驗為陽性。

2種試劑檢測出試驗HI效價（log2）情況如下。

（1）禽流感病毒H7N9（RE-2株）試驗HI效價（log2）按照原始編號（1-30）結(jié)果分別為12、11、11、12、12、13、11、11、12、12、11、12、12、12、11、13、12、11、12、11、13、13、12、11、12、11、12、12、13、11;根據(jù)禽流感抗體效價公式，11log2比正確血凝效價8log2多3個滴度（Y=3），抗體效價（log2）=試驗抗體效價-3，求得禽流感病毒H7N9（RE-2株）HI效價（log2）按照原始編號（1-30）結(jié)果分別為9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8;

（2）新城疫血凝抑制試驗抗原的試驗HI效價（log2）按照原始編號（1～30）結(jié)果分別為12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、11、12、12、12、12、12、11、12、12;根據(jù)新城疫抗體效價公式，12log2比正確血凝效價10log2多2個滴度（Y=2），抗體效價（log2）=試驗抗體效價-2，求得新城疫HI效價（log2）按照原始編號（1～30）結(jié)果分別為10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。

本檢測方法和傳統(tǒng)檢測方法技術相比，在用于禽流感和新城疫血凝抑制試驗檢測方中經(jīng)過大量試驗證明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制試驗抗體效價公式，設定11log2為禽流感參照血凝效價，設定12log2為新城疫固定的參照血凝效價，能夠直接進行血凝抑制試驗并運用禽流感、新城疫血凝抑制試驗抗體效價公式，求得HI抗體效價，其結(jié)果與正確抗體效價完全一致[2]。

2 加樣階段注意事項

（1）取樣環(huán)節(jié)。移液器要按至首個檔停點，在排樣階段要求要按至第二檔停點才能保證樣品整體排出并保證取樣量精準。

（2）吸液環(huán)節(jié)。去除吸頭外部吸附的多余液體，拇指松開速度要平穩(wěn)緩慢，不要出現(xiàn)快速松開的操作，要順著沿壁滑出吸頭。

（3）加樣階段。吸頭與V板孔不應觸及，以此減少交叉污染。按照比例稀釋樣品的過程中，拇指要緩慢按壓松開移液器按鈕。

（4）實際檢測。對盛放抗原液的加樣槽壁也要做出特殊標識[3]。

3 結(jié)論

采用血凝抑制試驗（HI）檢測禽流感與新城疫病毒會受到多種因素共同影響檢測結(jié)果精確度，工作人員要在試驗中嚴格控制試驗條件，嚴格依據(jù)規(guī)范要求配置紅細胞懸液，合理控制溫度及時間，力爭把影響降至最低。

參考文獻

[1] 解慧梅，李偉偉，羅天雨，等.甪直地區(qū)鵝副黏病毒病的流行病學調(diào)查[J].甘肅科技，2019，35（12）：136-138.

[2] 任義品，韓渝濠.血凝抑制試驗4單位抗原的配置方法探討[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2019，14（2）：10-11.

[3] 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：128-132.

作者簡介：李宇剛（1976-），男，山東威海人，本科，獸醫(yī)師，研究方向：畜牧獸醫(yī)。