黃真池 廖春曉 賴少娟 林文雙 袁長(zhǎng)春

(嶺南師范學(xué)院，湛江，524048)

桉樹(Eucalyptus)具有生長(zhǎng)快、輪伐期短、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)南方速生豐產(chǎn)林戰(zhàn)略樹種，在緩解木材等林產(chǎn)品短缺方面發(fā)揮著重要的作用[1]。遺傳控制、培育優(yōu)良的抗性品種有利于桉樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。但是，桉樹雜合度高、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，常規(guī)育種困難[3]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可定向快速改良物種性狀。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的前提是攜帶外源基因的愈傷組織細(xì)胞能夠啟動(dòng)細(xì)胞分裂分化，得到轉(zhuǎn)基因植株[4]。桉樹再生的關(guān)鍵是愈傷組織啟動(dòng)分化形成不定芽。因此，研究愈傷分化機(jī)理，建立桉樹高效再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系是對(duì)其進(jìn)行遺傳改良的基礎(chǔ)[5]。

植物細(xì)胞中ROS的代謝平衡與其細(xì)胞分裂、分化及發(fā)育等有重要關(guān)系[6]。細(xì)胞中的保護(hù)酶和抗氧化劑共同調(diào)節(jié)ROS的平衡，保護(hù)酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶等，抗氧化劑有維生素C、維生素E、谷胱甘肽等[7]。細(xì)胞ROS代謝失去平衡，ROS積累、發(fā)生膜質(zhì)過(guò)氧化、引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和生物大分子功能喪失。外植體在切傷刺激和離體培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生ROS的過(guò)度積累，會(huì)引起植物細(xì)胞膜系統(tǒng)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷，是外植體褐化的重要因素之一[8]。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)是一種主要的活性氧清除酶，分布于葉綠體、胞漿和過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器中，以抗壞血酸為電子供體，催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)ROS代謝平衡中起著重要作用[9]。能正常發(fā)育的愈傷組織具有一套高效的抗氧化系統(tǒng)或氧化應(yīng)激機(jī)制來(lái)保持自身較強(qiáng)的分化能力[10]。APX酶活性變化及APX基因表達(dá)變化可以反映細(xì)胞在分化和發(fā)育過(guò)程中的生理狀態(tài)[11]。侯大強(qiáng)等[12]發(fā)現(xiàn)APX在春石斛蘭類原球莖分化芽的過(guò)程中存在明顯的變化，表明可通過(guò)有針對(duì)性地在培養(yǎng)基中添加該酶的促進(jìn)或抑制劑來(lái)調(diào)控類原球莖的生長(zhǎng)或分化。王鳳華等[13]采用mRNA差異顯示技術(shù)在龍眼體胚發(fā)生早期發(fā)現(xiàn)APX基因的表達(dá)與體胚發(fā)生有密切聯(lián)系。郭玉瓊等[14]研究表明胞質(zhì)型APX基因在茶樹體胚發(fā)生過(guò)程中的萌發(fā)胚階段可能發(fā)揮著重要作用。過(guò)表達(dá)APX的轉(zhuǎn)基因擬南芥組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體細(xì)胞積累H2O2減少，促進(jìn)了愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽再生[15]。

目前，有關(guān)桉樹愈傷分化與APX表達(dá)關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。愈傷分化過(guò)程中過(guò)氧化物酶體、胞漿和葉綠體中APX轉(zhuǎn)錄如何變化尚需探討。本研究分析不同愈傷組織APX酶活性，比較過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中APX基因的轉(zhuǎn)錄變化，為研究桉樹愈傷組織不定芽分化的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

尾葉桉種子用自來(lái)水浸泡2 h，0.2% Triton-100試劑浸泡25 min，并用蒸餾水沖洗后消毒：用體積分?jǐn)?shù)70%酒精消毒30 s，再用體積分?jǐn)?shù)10% NaClO溶液消毒2次，每次7 min，消毒期間用無(wú)菌水漂洗，洗凈NaClO的殘留后，將種子播種到播種培養(yǎng)基(1/2MS+蔗糖20 g/L+瓊脂7.5 g/L，pH值5.8～6.0)，置于25 ℃暗處萌發(fā)。

取8 d苗齡的幼苗，切取0.8～1.0 cm下胚軸作為外植體，接種在添加3.99 mmol/L PBU、0.57 mmol/L 6-BA、0.57 mmol/L IAA和100 mg·L-1Vc的SPCa培養(yǎng)基(679.32 mg·L-1CaCl2、1/4MS鐵鹽、1/2MS其他無(wú)機(jī)鹽和15 g/L蔗糖)中。(25±2)℃條件下黑暗處理2周后，轉(zhuǎn)移至16 h光/8 h暗光周期、光照度50 μmol/m2·s、溫度(25±2)℃的人工氣候箱培養(yǎng)12周，統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)情況。

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：稱取4種類型愈傷組織各0.1 g置于具塞試管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇于黑暗條件下浸泡24 h。測(cè)A665和A649，將測(cè)得的值代入公式Cchl(mg/L)=6.63A665+18.08A649，計(jì)算葉綠素總質(zhì)量濃度和葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

酶活性測(cè)定：稱取4種類型愈傷組織各0.2 g(每種樣品重復(fù)3次)，加100 mg PVPP，4 mL酶提取液(50 mmol/L pH值7.0 Tris-HCl緩沖液，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/Lβ—巰基乙醇)，冰浴勻漿后，將勻漿液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，所得上清即為粗酶液。酶液蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[16]；APX酶活性檢測(cè)參考文獻(xiàn)[11]的方法。

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：3種類型愈傷組織各稱取100 mg材料于液氮中研磨成細(xì)粉，加入1 mL RNAiso Plant Tissue勻漿。按RNAiso Plus試劑說(shuō)明書步驟提取總RNA，并用Nanodrop 2000c檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。反轉(zhuǎn)錄按文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行，得到初始cDNA，備用。所有試劑均是寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

目的基因選擇及引物設(shè)計(jì)：通過(guò)檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和Phytozome 12數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找已報(bào)道的桉樹APX基因，并將能在尾葉桉中有效擴(kuò)增的9個(gè)APX基因編號(hào)為APX1至APX9。其中編碼過(guò)氧化物酶體APX(Peroxisomal APX,pAPX)的3個(gè)基因編號(hào)為APX1—3，編碼細(xì)胞質(zhì)APX(cytosolic APX,cAPX)的3個(gè)基因編號(hào)為APX4—6，編碼葉綠體APX(chloroplastic APX,chAPX)的3個(gè)基因編號(hào)為APX7—9。用primer3plus軟件設(shè)計(jì)qPCR引物。內(nèi)參基因RTEF和9個(gè)APX基因的編號(hào)和引物序列見表1。

表1 內(nèi)參基因和9個(gè)APX基因的編號(hào)、位置和引物序列

qPCR擴(kuò)增：qPCR反應(yīng)儀器為CFX-96Touch(Bio-Rad)；25 μL反應(yīng)體系：SYBR PremixTaqTMⅡ 12.5 μL，10 μmol/L Primer F和Primer R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，15 s。用2-ΔΔCt法[18]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾葉桉不同類型愈傷組織特征及APX酶活性變化

下胚軸接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周后，尾葉桉愈傷組織分化形成白色、紅色、綠色和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織等類型。白色愈傷組織表面較為光滑、質(zhì)地疏松，紅色愈傷組織呈粉紅色、質(zhì)地稍致密，綠色愈傷組織呈綠色，有光澤、細(xì)胞團(tuán)致密，表面有顆粒狀突起。綠色愈傷組織表面可分化出綠色芽點(diǎn)、頂芽和幼葉清晰可見，后續(xù)培養(yǎng)中芽點(diǎn)伸長(zhǎng)長(zhǎng)出不定芽(圖1)。4種愈傷組織葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從低到高依次為白色、紅色、綠色、帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織，白色愈傷組織的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.019 mg/g，帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.208 mg/g(表2)。結(jié)合愈傷組織顏色差別，可推知綠色愈傷組織的葉綠體已啟動(dòng)發(fā)育。12周后，白色和紅色愈傷組織開始褐變壞死，而80%以上綠色愈傷組織可分化出不定芽?？梢?周前誘導(dǎo)形成綠色愈傷組織是桉樹再生的關(guān)鍵。

A.白色愈傷組織；B.紅色愈傷組織；C.綠色愈傷組織；D.帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織；E.不定芽。

白色愈傷組織中APX酶活性最低。從白色愈傷組織分化成紅色、綠色或帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織的過(guò)程伴隨著APX酶活性的明顯升高(表2)。后續(xù)培養(yǎng)中APX酶活性最高的紅色愈傷組織不能形成不定芽，APX酶活性稍低的綠色愈傷組織有80%以上可分化出不定芽。推測(cè)愈傷組織的分化除了受APX酶活性的影響，還與APX酶在細(xì)胞中的定位有關(guān)。

表2 尾葉桉不同類型愈傷組織APX酶活性

2.2 尾葉桉不同類型愈傷組織9個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

2.2.1過(guò)氧化物酶體中3個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

設(shè)紅色愈傷組織基因的相對(duì)表達(dá)量為1，3種不同類型愈傷組織的基因表達(dá)量存在顯著差異(表3)。與紅色愈傷組織相比，綠色愈傷組織和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織中位于過(guò)氧化物酶體的3個(gè)APX基因的表達(dá)量均上調(diào)，且?guī)а奎c(diǎn)綠色愈傷組織APX相對(duì)表達(dá)量顯著高于綠色愈傷組織。過(guò)氧化物酶體中3個(gè)APX基因表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了不定芽的分化。

表3 尾葉桉不同類型愈傷組織過(guò)氧化物酶體中3個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

2.2.2細(xì)胞質(zhì)中3個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

3種愈傷組織胞質(zhì)APX4基因轉(zhuǎn)錄變化不明顯。與紅色愈傷組織相比，綠色愈傷組織和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織胞質(zhì)APX5和APX6基因表達(dá)量均上升(表4)?？傮w來(lái)看，胞質(zhì)APX表達(dá)增強(qiáng)有利于不定芽芽點(diǎn)的分化。但胞質(zhì)APX同工酶基因的變化不盡相同。

表4 尾葉桉不同類型愈傷組織細(xì)胞質(zhì)中3個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

2.2.3葉綠體中3個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

3種不同類型愈傷組織葉綠體3個(gè)APX基因表達(dá)量均存在顯著性差異(表5)。綠色愈傷組織和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織的APX7和APX8的基因表達(dá)量顯著高于紅色愈傷組織。兩者APX8的相對(duì)表達(dá)量分別為紅色愈傷組織的21.0和29.4倍。APX7和APX8表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了綠色愈傷組織分化和芽點(diǎn)形成。APX8定位于葉綠體，相對(duì)表達(dá)量劇增與綠色愈傷組織和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織中葉綠體的發(fā)育和數(shù)量倍增有關(guān)。綠色愈傷組織和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織的APX9的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明同一細(xì)胞器中的APX同工酶的功能不同或影響愈傷分化的作用不同。

表5 尾葉桉不同類型愈傷組織葉綠體中3個(gè)APX基因轉(zhuǎn)錄水平變化

3 結(jié)論與討論

根據(jù)亞細(xì)胞定位，高等植物APX分為4個(gè)亞家族，分別是細(xì)胞質(zhì)APX、線粒體APX、葉綠體APX和過(guò)氧化物酶體APX[19-20]。在過(guò)氧化物酶體中，ROS是光呼吸、脂肪酸β氧化和酰脲代謝等的副產(chǎn)物。雖然CAT能夠清除高濃度的H2O2，但其與H2O2親和力低。相反，APX與H2O2親和力高，可顯著降低H2O2的濃度，防止H2O2從過(guò)氧化物酶體中泄漏出去[21]。pAPX的N端活性結(jié)構(gòu)域面向胞漿，C端結(jié)構(gòu)域起著錨定作用并促進(jìn)酶功能的實(shí)現(xiàn)[22]。過(guò)表達(dá)pAPX可增強(qiáng)花生的耐鹽性[23]。目前未見pAPX表達(dá)與愈傷組織分化相關(guān)的報(bào)道。試驗(yàn)中，3個(gè)過(guò)氧化物酶體APX基因(APX1、APX2、APX3)的相對(duì)表達(dá)量均為帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織最高。表明定位于過(guò)氧化物酶體的APX類基因表達(dá)量上調(diào)能提高pAPX同工酶活性，清除愈傷組織過(guò)量的ROS，減輕ROS對(duì)細(xì)胞的毒害，有利于綠色愈傷組織形成和芽點(diǎn)的分化。

胞質(zhì)APX可清除H2O2，減少H2O2向葉綠體流入。當(dāng)缺乏細(xì)胞質(zhì)APX時(shí)，將導(dǎo)致葉綠體H2O2清除系統(tǒng)崩潰、H2O2濃度升高、蛋白質(zhì)被氧化[24]。與下胚軸相比，2周齡尾葉桉愈傷組織胞質(zhì)APX5和APX6基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而胞質(zhì)APX4基因的轉(zhuǎn)錄則顯著上調(diào)[11]。本試驗(yàn)中，具有芽分化能力的綠色和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織胞質(zhì)APX5和APX6基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。不同愈傷組織間胞質(zhì)APX4基因表達(dá)變化不明顯。說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)APX基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)有助于保護(hù)葉綠體H2O2清除系統(tǒng)，促進(jìn)愈傷組織葉綠體的發(fā)育。

葉綠體作為光合作用的場(chǎng)所與其他細(xì)胞器相比更易遭受氧化脅迫的傷害[25]。由于葉綠體中無(wú)CAT，APX在葉綠體中起著關(guān)鍵作用[9]。葉綠體有兩種APX同工酶，即類囊體結(jié)合型和基質(zhì)結(jié)合型APX，在光氧化脅迫下的光保護(hù)和基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮雙重作用[26]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織葉綠體APX7、APX8的表達(dá)量顯著高于其它類型愈傷組織。APX8在綠色愈傷組織和帶芽點(diǎn)綠色愈傷組織中顯著上調(diào)，分別為紅色愈傷組織的21.0倍和29.4倍。推測(cè)葉綠體中APX8的顯著上調(diào)與愈傷組織葉綠體發(fā)育、葉綠體數(shù)量倍增和芽原基形成密切相關(guān)。

綜上所述，尾葉桉愈傷組織在切傷刺激和離體培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)提高APX酶活性以降低活性氧傷害。過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中的APX基因總體表達(dá)上調(diào)有利于清除體內(nèi)過(guò)量的ROS，促進(jìn)芽原基的分化和不定芽的形成。綠色愈傷和帶芽點(diǎn)綠色愈傷中葉綠體APX8轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，說(shuō)明APX8表達(dá)與葉綠體發(fā)育密切相關(guān)。本研究可為提高尾葉桉不定芽誘導(dǎo)率積累資料，為深入研究桉樹愈傷組織分化的分子機(jī)理提供參考。