歐有冠，朱蕾，魯才杰

胃癌在惡性腫瘤中十分常見，其發(fā)生率和致死率在國內(nèi)常見腫瘤中均排名第2位，對患者的健康和生命安全帶來極大的威脅和困擾[1]。根據(jù)2015年流行病學(xué)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌在國內(nèi)年新發(fā)人數(shù)超過60萬，死亡人數(shù)高達(dá)40多萬，其發(fā)生率和致死率均排在了全部癌癥中的第2位，因大部分患者在診斷時已發(fā)生了轉(zhuǎn)移，5年生存率不到10%[2]。胃癌細(xì)胞的分裂增殖以及轉(zhuǎn)移機制當(dāng)前還未定論，缺乏對胃癌預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，對胃癌的療效影響十分嚴(yán)重[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，鐵對于腫瘤細(xì)胞的分裂增殖具有促進(jìn)作用，大多數(shù)腫瘤均表現(xiàn)出鐵的供應(yīng)量不足，一些可對鐵代謝異常進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白表達(dá)可顯著影響腫瘤細(xì)胞的分裂增殖及轉(zhuǎn)移[4]。鐵調(diào)素是近年來發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，其可促進(jìn)膜轉(zhuǎn)鐵蛋白(ferroportin,FPN)低表達(dá)和誘導(dǎo)其降解對鐵代謝異常進(jìn)行調(diào)節(jié)，故推測FPN可能在鐵代謝中具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。而肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidylprolyl cis-trans isomerase，PIN1)屬于高度保守且特異的磷酸化異構(gòu)酶，高表達(dá)于大多數(shù)類型的腫瘤中[5]。本研究對30例胃癌患者的腫瘤組織標(biāo)本與10例胃癌患者的癌旁正常胃黏膜組織中PIN1、FPN的表達(dá)水平進(jìn)行了測定，分析了2者與胃癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院2017年2月至2020年2月手術(shù)切除的30例胃癌患者的存檔胃部腫瘤組織蠟塊，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。其中，男20例，女10例，中位年齡55歲；TNM分期符合2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]，T1、T2期13例，T3、T4期17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。另選取10例胃癌患者的癌旁正常胃黏膜組織作為對照。所有患者術(shù)前均未接受過放化療，所有標(biāo)本均由2名專家進(jìn)行確認(rèn)。

1.2 方法 胃癌組織和正常胃黏膜組織標(biāo)本均經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定、石蠟包埋以及4～6 μm連續(xù)切片。PIN1兔抗多克隆IgG抗體購自北京博爾西科技有限公司，使用稀釋液將抗體進(jìn)行稀釋，稀釋度為1：50。免疫組化反應(yīng)液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。用PBS代替一抗作為空白對照，用購買的已知陽性切片作為陽性對照，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。所有組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、蘇木素—伊紅染液(HE)染色后，在光學(xué)顯微鏡下相應(yīng)找到其石蠟組織塊上已標(biāo)記的腫瘤組織，制作成10×16組織陣列(每個標(biāo)本取2個芯點，直徑1.6 mm)，共制作成3個蠟塊。正常胃黏膜組織取自距腫瘤≥7 cm的胃黏膜組織。PIN1蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞質(zhì)，顯示棕黃色為陽性。免疫組化反應(yīng)結(jié)果判定方法：腫瘤組織或腺體組織超過芯片點的10%為有效病例。用同一標(biāo)本癌組織陽性染色區(qū)域，進(jìn)行不低于10個視野的觀察，結(jié)果以100個細(xì)胞計算染色強度指數(shù)(staining intensity index, SII)：<6%為(-)，6%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>50%為(+++)；(+)～(+++)均計為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，陽性表達(dá)率為計數(shù)資料，以百分比表示，行χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PIN1、FPN蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的陽性表達(dá)率 FPN在正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)率為80.0%(8例)，高于胃癌組織中的50.0%(15例)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PIN1在正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)率為20.0%(2例)，低于胃癌組織中PIN1蛋白陽性表達(dá)率33.3%(10例)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 PIN1、FPN表達(dá)與胃癌組織臨床病理參數(shù)的關(guān)系 30例胃癌組織標(biāo)本中按患者年齡、性別、臨床TNM分期分組中，PIN1蛋白陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無分組中，PIN1蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在胃癌TNM分期分組中，F(xiàn)PN蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在年齡、性別、有無腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中，F(xiàn)PN蛋白陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 PIN1和FPN表達(dá)與胃癌組織臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

3 討論

PIN1是由人PIN1基因編碼的一種對有絲分裂進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白，主要存在于細(xì)胞核中，其中包括一個核定位信號(nuclear localization signal, NLS)以及2個功能區(qū)域，功能區(qū)域其中一個為N端的色氨酸-色氨酸中心區(qū)WW,另一個是C端的PIN1 PPlase活性區(qū)[7]。相比其他腫瘤標(biāo)志物，PIN1可催化癌變[8]。PIN1具有的2個相互獨立結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中WW可與絲氨酸/蘇氨酸-脯氨酸(phosphor-Ser-Pro or phosphor-ThrPro, pSer/Thr-Pro)基序發(fā)生特異性結(jié)合，PIN1 PPlase活性區(qū)則可對底物異構(gòu)產(chǎn)生催化作用。上述PIN1的2個獨立結(jié)構(gòu)區(qū)域協(xié)同合作對底物順反異構(gòu)產(chǎn)生催化作用，此種構(gòu)象可對 PIN1多種底物蛋白的功能產(chǎn)生較大的影響。比如，真核細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵激酶 Polo樣蛋白質(zhì)激酶1(polo-like kinase1,PLK1)和周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)以及2種酶的底物均與PIN1產(chǎn)生作用，通過這些作用，PIN1可對有絲分裂的時空產(chǎn)生影響。與pSer/Thr-Pro結(jié)構(gòu)區(qū)域相結(jié)合，可改變磷酸化蛋白的構(gòu)象，從而對其功能和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[9]。

PIN1陽性表達(dá)于大量的腫瘤細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，均呈現(xiàn)出不同的染色情況。本研究中在胃癌組織中PIN1蛋白陽性表達(dá)率高于正常胃黏膜組織，提示PIN1在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展過程中產(chǎn)生一定的影響。在與其臨床病理參數(shù)的比較中，筆者發(fā)現(xiàn)在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中PIN1蛋白表達(dá)差異顯著，與相關(guān)研究結(jié)果一致；但某些方面存在不一致性，筆者考慮原因在于PIN1抗體的分類號、稀釋度、標(biāo)本量、免疫組化反應(yīng)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)等存在差異。

周期蛋白(cyclin)中的CyclinD1是細(xì)胞周期中與腫瘤關(guān)系緊密的癌基因。PIN1的目標(biāo)蛋白超過20種，其中最受研究者關(guān)注的是CyclinD1，CyclinD1是細(xì)胞周期中的G1期相關(guān)蛋白，其基因和編碼蛋白發(fā)生異常對腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展影響較大[10]。相關(guān)研究表明，CyclinD1是PIN1十分重要的作用目標(biāo)蛋白之一，PIN1不但可促進(jìn)CyclinD1轉(zhuǎn)錄，而且還可誘導(dǎo)CyclinD1從胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中進(jìn)行降解，使得CyclinD1高表達(dá)，促使乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖[11]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，PIN1在正常乳腺組織中陰性表達(dá)，只在乳腺癌組織中陽性表達(dá)。在PIN1高表達(dá)的60例乳腺癌中42例合并CyclinD1高表達(dá)，而在PIN1低表達(dá)的48例乳腺癌中僅有25例CyclinD1陰性表達(dá)，同時CyclinD1表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)系[12]。PIN1不管是激活Ras信號傳導(dǎo)途徑還是應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)，目標(biāo)均是為了提升c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性。另有研究發(fā)現(xiàn)，PIN1在人類乳腺癌組織中過表達(dá)，在正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌旁組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理分期存在相關(guān)性。國內(nèi)研究者通過蛋白質(zhì)體學(xué)在胃癌差異蛋白質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)PIN1高表達(dá)[11]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織PIN1陽性表達(dá)率明顯高于對照組，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)系，提示PIN1可能參與腫瘤產(chǎn)生、進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移過程。國外研究者發(fā)現(xiàn)，PIN1表達(dá)與前列腺癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的危險性存在顯著相關(guān)性，高表達(dá)者復(fù)發(fā)的危險性高于低表達(dá)者[10]。另有研究表明，過表達(dá)的PIN1可促進(jìn)正常乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且可穩(wěn)固已被neu(c-erbB-2)和Ras癌基因誘導(dǎo)的惡性表型，敲除PIN1則可逆轉(zhuǎn)此種惡性表型，甚至還會引發(fā)癌細(xì)胞凋亡[9]。故對PIN1表達(dá)進(jìn)行測定對于腫瘤的診斷和治療、預(yù)后具有一定的預(yù)測價值，并可作為潛在的治療目標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)PN在胃癌組織中低表達(dá)，且與胃癌的TNM分期存在相關(guān)性，與患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)性。大量研究亦報道了FPN在不同類型腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義[8-10]。國外研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者的FPN mRNA呈低表達(dá)，且與乳腺癌的預(yù)后有明顯關(guān)系[8]。故筆者認(rèn)為在胃癌組織中FPN是鐵調(diào)素的下游目標(biāo)之一，鐵調(diào)素通過促進(jìn)FPN低表達(dá)以及誘導(dǎo)FPN降解來對鐵代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，繼而對腫瘤細(xì)胞的分裂增殖產(chǎn)生影響。此與相關(guān)國外研究結(jié)果一致。

綜上所述，胃癌組織中存在FPN、PIN1蛋白陽性表達(dá)，且與患者的臨床病理參數(shù)相關(guān)，今后筆者將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，使FPN、PIN1有可能作為判定胃癌TNM分期和高危轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)，并用于臨床指導(dǎo)胃癌的治療。